(一)目的要求
了解IMViC與硫化氫反應的原理及其在腸道菌鑒定中的意義和方法。
(二)基本原理
IMViC是吲哚(indol test)、甲基紅(methy1 red test)、伏一普(Voges-Prokauer test)和檸檬酸鹽(citrate test)四個試驗的縮寫，I是在英文中為了發音方便而加上的。這四個試驗主要是用來快速鑒別大腸杆菌和產氣腸杆菌(Enterobacter aerogenes)，多用於水的細菌學檢查。大腸杆菌雖非致病菌，但在飲用水中若超過一定數量，則表示受糞便汙染。產氣腸杆菌也廣泛存在於自然界中，因此檢查水時要將兩者分開。
硫化氫試驗也是檢查腸道杆菌的生化試驗。
吲哚試驗是用來檢測吲哚的產生。有些細菌能產生色氨酸酶，分解蛋白腖中的色氨酸產生吲哚和丙酮酸。吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結合，形成紅色的玫瑰吲哚。但並非所有微生物都具有分解色氨酸產生吲哚的能力，因此吲哚試驗可以作為一個生物化學檢測的指標。
色氨酸水解反應：
吲哚與對二甲基氨基苯甲醛反應：
大腸杆菌吲哚反應陽性，產氣腸杆菌為陰性。
甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產生的有機酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。當細菌代謝糖產生酸時，培養基就會變酸，使加入培養基的甲基紅指示劑由橘黃色(pH6.3)變為紅色(pH4.2)，即甲基紅反應。盡管所有的腸道微生物都能發酵葡萄糖產生有機酸，但這個試驗在區分大腸杆菌和產氣腸杆菌上仍然是有價值的。這兩個細菌在培養的早期均產生有機酸，但大腸杆菌在培養後期仍能維持酸性pH4，而產氣腸杆菌則轉化有機酸為非酸性末端產物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大約6。因此大腸杆菌為陽性反應，產氣腸杆菌為陰性反應。
伏-普試驗是用來測定某些細菌利用葡萄糖產生非酸性或中性末端產物的能力，如丙酮酸。丙酮酸進行縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰。二乙酰與蛋白腖中精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，即伏-普反應陽性；不產生紅色化合物者為陰性反應。有時為了使反應更為明顯，可加入少量含胍基的化合物，如肌酸等。
其化學反應過程如下：
檸檬酸鹽試驗是用來檢測檸檬酸鹽是否被利用。有些細菌能夠利用檸檬酸鈉作為碳源，如產氣腸杆菌；而另一些細菌則不能利用檸檬酸鹽，如大腸杆菌。細菌在分解檸檬酸鹽及培養基中的磷酸銨後，產生堿性化合物，使培養基的pH升高，當加入1%溴麝香草酚藍指示劑時，培養基就會由綠色變為深藍色。溴麝香草酚藍的指示範圍為：pH小於6.0時呈黃色，pH在6.0~7.0時為綠色，pH大於7.6時呈藍色。
硫化氫試驗是檢測硫化氫的產生，也是用於腸道細菌檢查的常用生化試驗。有些細菌能分解含硫的有機物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等產生硫化氫，硫化氫一遇培養基中的鉛鹽或鐵鹽等，就形成黑色的硫化鉛或硫化鐵沉澱物。
以半胱氨酸為例，其化學反應過程如下：
CH2SHCHNH2COOH+H2O→CH3COCOOH+H2S↑+NH3↑
H2S+Pb（CH3COO）2→PbS↓+2CH3COOH
（黑色）
大腸杆菌為陰性，產氣腸杆菌為陽性。
(三)器材
l．菌種 大腸杆菌，產氣腸杆菌。
2．培養基 蛋白腖水培養基，葡萄糖蛋白腖水培養基，檸檬酸鹽斜麵培養基，醋酸鉛培養基。
在配製檸檬酸鹽斜麵培養基時，其pH不要偏高，以淺綠色為宜，吲哚試驗中用的蛋白腖水培養基中宜選用色氨酸含量高的蛋白腖，如用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋白腖較好。
3．溶液或試劑 甲基紅指示劑，40%KOH，5%α-萘蔡酚，乙醚，吲哚試劑等。
(四)操作步驟
l．接種與培養
(1)用接種針將大腸杆菌、產氣腸杆菌分別穿刺接入2支醋酸鉛培養基中(硫化氫試驗)，置37C培養48h。
(2)將上述二菌分別接種於2支蛋白腖水培養基(吲哚試驗),2支葡萄糖蛋白腖水培養基(甲基紅試驗和伏-普試驗)，2支檸檬酸鹽斜麵培養基和2支醋酸鉛培養基中，置37℃培養2d。
2．結果觀察
(1)硫化氫試驗 培養48h後觀察黑色硫化鉛的產生。
(2)吲哚試驗 於培養2d後的蛋白腖水培養基內加3~4滴乙醚，搖動數次，靜置1~3min，待乙醚上升後，沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑，在乙醚和培養物之間產生紅色環狀物為陽性反應。
配製蛋白腖水培養基，所用的蛋白腖最好用含色氨酸高的，如用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋白腖中色氨酸含量較高。
(3)甲基紅試驗 培養2d後，將l支葡萄糖蛋白腖水培養物內加入甲基紅試劑2滴，培養基變為紅色者為陽性，變黃色者為陰性。
注意甲基紅試劑不要加得太多，以免出現假陽性反應。
(4)伏-普試驗培養2d後，將另1支葡萄糖蛋白腖水培養物內加入5~10滴40%KOH，然後加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃溫箱中保溫15~30min，以加快反應速度。若培養物呈紅色者，為伏-普反應陽性。
(5)檸檬酸鹽試驗培養48h後觀察檸檬酸鹽敘麵培養基上有無細菌生長和是否變色。藍色為陽性，綠色為陰性。
五、實驗報告
1．結果
將實驗結果填入下表。“+”表示陽性反應，“-”表示陰性反應。
2．思考題
(1)討論IMViC試驗在醫學檢驗上的意義。
(2)解釋在細菌培養中吲哚檢測的化學原理，為什麽在這個試驗中用吲哚的存在作為色氨酸活性的指示劑，而不用丙酮酸？
(3)為什麽大腸杆菌是甲基紅反應陽性，而產氣腸杆菌為陰性？這個試驗與伏一普試驗最初底物與最終產物有何異同處？為什麽會出現不同？
(4)說明在硫化氫試驗中，醋酸鉛的作用，可以用哪種化合物代替醋酸鉛？
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