(一)目的要求
1．證明不同微生物對各種有機大分子的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶係統。
2．掌握進行微生物大分子水解試驗的原理和方法。
(二)基本原理
微生物對大分子的澱粉、蛋白質和脂肪不能直接利用，必須靠產生的胞外酶將大分子物質分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要為水解酶，通過加水裂解大的物質為較小的化合物，使其能被運輸至細胞內。如澱粉酶水解澱粉為小分子的糊精、雙糖和單糖；脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白質為氨基酸等。這些過程均可通過觀察細菌菌落周圍的物質變化來證實：澱粉遇碘液會產生藍色，但細菌水解澱粉的區域，用碘測定不再產生藍色，表明細菌產生澱粉酶。脂肪水解後產生脂肪酸可改變培養基的pH，使pH降低，加入培養基的中性紅指示劑會使培養基從淡紅色變為深紅色，說明胞外存在著脂肪酶。
微生物可以利用各種蛋白質和氨基酸作為氮源外，當缺乏糖類物質時，亦可用它們作為碳源和能源。明膠是由膠原蛋白經水解產生的蛋白質，在25℃以下可維持凝膠狀態，以固體形式存在。而在25℃以上明膠就會液化。有些微生物可產生一種稱作明膠酶的胞外酶，水解這種蛋白質，而使明膠液化，甚至在4℃仍能保持液化狀態。
還有些微生物能水解牛奶中的蛋白質酪素，酪素的水解可用石蕊牛奶來檢測。石蕊培養基由脫脂牛奶和石蕊組成，是昏濁的藍色。酪素水解成氨基酸和肽後，培養基就會變得透明。石蕊牛奶也常被用來檢測乳糖發酵，因為在酸存在下，石蕊會轉變為粉紅色，而過量的酸可引起牛奶的固化(凝乳形成)。氨基酸的分解會引起堿性反應，使石蕊變為紫色。此外，某些細菌能還原石蕊，使試管底部變為白色。
尿素是由大多數哺乳動物消化蛋白質後被分泌在尿中的廢物。尿素酶能分解尿素釋放出氨，這是一個分辨細菌很有用的診斷實驗。盡管許多微生物都可以產生尿素酶，但它們利用尿素的速度比變形杆菌屬(Proteus)的細菌要慢，因此尿素酶試驗被用來從其他非發酵乳糖的腸道微生物中快速區分這個屬的成員。尿素瓊脂含有蛋白腖，葡萄糖，尿素和酚紅。酚紅在pH6.8時為黃色，而在培養過程中，產生尿素酶的細菌將分解尿素產生氨，使培養基的pH升高，在pH升至8.4時，指示劑就轉變為深粉紅色。
(三)器材
1．菌種 枯草芽胞杆菌，大腸杆菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，普通變形杆菌。
2．培養基 固體油脂培養基，固體澱粉培養基，明膠培養基試管，石蕊牛奶試管，尿素瓊脂試管。
3．溶液或試劑 革蘭氏染色用盧戈氏碘液(Lugol’s iodine solution)。
4．儀器或其他用具 無菌平板，無菌試管，接種環，接種針，試管架。
(四)操作步驟
l．澱粉水解試驗
(1)將固體澱粉培養基溶化後冷卻至50℃左右，無菌操作製成平板。
(2)用記號筆在平板底部劃成四部分。
(3)將枯草芽孢杆菌，大腸杆菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌分別在不同的部分劃線接種，在平板的反麵分別在四部分寫上菌名。
(4)將平板倒置在37℃溫箱中培養24h。
(5)觀察各種細菌的生長情況，將平板打開蓋子，滴入少量Lugol’s碘液於平皿中，輕輕旋轉平板，使碘液均勻鋪滿整個平板。
如菌苔周圍出現無色透明圈，說明澱粉己被水解，為陽性。透明圈的大小可初步判斷該菌水解澱粉能力的強弱，即產生胞外澱粉酶活力的高低。
2．油脂水解試驗
(1)將溶化的固體油脂培養基冷卻至50℃左右時，充分搖蕩，使油脂均勻分布。無菌操作倒入平板，待凝。
(2)用記號筆在平板底部劃成四部分，分別標上菌名。
(3)將上述四種菌分別用無菌操作劃+字接種於平板的相對應部分的中心。
(4)將平板倒置，於37℃溫箱中培養24h。
(5)取出平板，觀察菌苔顏色，如出現紅色斑點說明脂肪水解，為陽性反應。
3．明膠水解試驗
(1)取三支明膠培養基試管，用記號筆標明各管欲接種的菌名。
(2)用接種針分別穿刺接種(見圖3—4B)枯草芽抱杆菌，大腸杆菌，金黃色葡萄球菌。
(3)將接種後的試管置20℃中，培養2～5d。
(4)觀察明膠液化情況(圖16-1)。
4．石蕊牛奶試驗
(1)取兩支石蕊牛奶培養基試管，用記號筆標明各管欲接種的菌名。
(2)分別接種普通變形杆菌和金黃色葡萄球菌。
(3)將接種後的試管置35℃中，培養24～48h。
(4)觀察培養基顏色變化。石蕊在酸性條件下為粉紅色，堿性條件下為紫色，而被還原時為白色。
5．尿素試驗
(1)取兩支尿素培養基斜麵試管，用記號筆標明各管欲接種的菌名。
(2)分別接種普通變形杆菌和金黃色葡萄球菌。
(3)將接種後的試管置35℃中，培養24~48h。
(4)觀察培養基顏色變化。尿素酶存在時為紅色，無尿素酶時應為黃色。
(五)實驗報告
1．結果
將結果填入下表，“+”表示陽性，“-”表示陰性。
2．思考題
(1)你怎樣解釋澱粉酶是胞外酶而非胞內酶？
(2)不利用碘液，你怎樣證明澱粉水解的存在？
(3)接種後的明膠試管可以在35℃培養，在培養後你必須做什麽才能證明水解的存在？
(4)解釋在石蕊牛奶中的石蕊為什麽能起到氧化還原指示劑的作用？
(5)為什麽尿素試驗可用於鑒定Proteus細菌？
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