(一)目的要求
1．通過細菌數量的測量了解大腸杆菌的生物特征和規律，繪製生長線。
2．複習光電比濁法測量細菌數量的方法。
(二)基本原理
大多數細菌的繁殖速率很快，在合適的條件下，一定時期的大腸杆菌細胞每20min分裂一次。將一定量的細菌轉入新鮮液體培養基中，在適宜的條件下培養細胞要經曆延遲期，對數期、穩定期和衰亡期四個階段。以培養時間為橫坐標，以細菌數目的對數或生長速率為縱坐標作圖所繪製的曲線稱為該細菌的生長曲線。不同的細菌在相同的培養條件下其生長曲線不同，同樣的細菌在不同的培養條件下所繪製的生長曲線也不相同。測定細菌的生長曲線，了解其生長繁殖規律，這對人們根據不同的需要，有效地利用和控製細菌的生長具有重要意義。
用於測定細菌細胞數量的方法已在上述實驗作了介紹。本實驗用分光光度計(spectrophotometer)進行光電比濁測定不同培養時間細菌懸浮液的OD值，繪製生長曲線。也可以直接用試管或帶有測定管的三角瓶(圖15-5)測定“klett units”值的光度計。如圖15—6所示，隻要接種1支試管或1個帶測定管的三角瓶，在不同的培養時間(橫坐標)取樣測定，以測得的klett units為縱坐標，便可很方便地繪製出細菌的生長曲線。如果需要，可根據公式1 klett units=OD/0.002換算出所測菌懸液的OD值。
(三)器材
1．菌種 大腸杆菌
2．培養基 LB液體培養基70ml，分裝2支大試管(5ml/支)，剩餘60ml裝入250ml的三角瓶。
3．儀器或其他用具 722型分光光度計，水浴振蕩搖床，無菌試管，無菌吸管等。
(四)操作步驟
1．標記
取11支無菌大試管，用記號筆分別標明培養時間，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。
2．接種
分別用5ml無菌吸管吸取2.5ml大腸杆菌過夜培養液(培養10~12h)轉入盛有50ml LB液的三角瓶內，混合均勻後分別取5ml混合液放入上述標記的11支無菌大試管中。
3．培養
將已接種的試管置搖床37℃振蕩培養(振蕩頻率250r/min)，分別培養0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，將標有相應時間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最後一同比濁測定其光密度值。
4．比濁測定
用未接種的LB液體培養基作空白對照，選用600nm波長進行光電比濁測定。從早取出的培養液開始依次測定，對細胞密度大的培養液用LB液體培養基適當稀釋後測定，使其光密度值在0.1~0.65之內(測定OD值前，將待測定的培養液振蕩，使細胞均勻分布)。
本操作步驟也可用簡便的方法代替：
1．用1ml無菌吸管取0.25ml大腸杆菌過夜培養液轉入盛有3~5ml LB液的試管中、混勻後將試管直接插入分光光度計的比色糟中，比色糟上方用自製的暗盒將試管及比色暗室全部罩上，形成一個大的暗環境，另以1支盛有LB液但沒有接種的試管調零點，測定樣品中培養0h的OD值。測定完畢後，取出試管置37℃繼續振蕩培養。
2．分別在培養0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培養物試管按上述方法測定OD值。該方法準確度高、操作簡便。但須注意的是使用的2支試管要很幹淨，其透光程度愈接近，測定的準確度愈高。
(五)實驗報告
1．結果
(1)將測定的OD600值填入下表：
(2)繪製大腸杆菌的生長曲線
2．思考題
(1)如果用活菌計數法製作生長曲線，你認為會有什麽不同？兩者各有什麽優缺點？
(2)細菌生長繁殖所經曆的四個時期中，哪個時期其代時最短？若細胞密度為103/ml，培養4.5h後，其密度高達2×108/ml，計計算出其代時。
(3)次生代謝產物的大量積累在哪個時期？根據細菌生長繁殖的規律，采用哪些措施可使次生代謝產物積累更多？
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