一、實驗目的和內容
目的：掌握細菌的芽孢及莢膜染色方法。
內容：1．細菌的芽泡染色。
2．細菌的莢膜染色。
二、實驗材料和用具
枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌的斜麵菌種。
二甲苯、香柏油、蒸餾水、5%孔雀綠水溶液、0.5%沙黃水溶液(或0.05%堿性複紅)、繪圖墨水(用濾紙過濾後備用)、95%乙醇、石炭酸複紅染液；
顯微鏡、接種環、酒精燈、載玻片、蓋玻片、小試管(l×6.5cm)、燒杯(300mL)、滴管、試管夾、擦鏡紙、吸水紙。
三、操作步驟
(一)芽孢染色法
1．方法1
(1)取37℃培養18～24h的枯草芽孢杆菌作塗片，並幹燥，固定(參見“細胞單染色法”)。
(2)於塗片上滴人3～5滴5%孔雀綠水溶液。
(3)用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現蒸汽時，開始計算時間約4～5min。加熱過程中切勿使染料蒸幹，必要時可添加少許染料。
(4)傾去染液，待玻片冷卻後，用自來水衝洗至孔雀綠不再褪色為止。
(5)用0.5%沙黃水溶液(或0.05%堿性複紅)複染lmin，水洗。
(6)製片幹燥後用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。
2．方法2
(1)加1～2滴自來水於小試管中，用接種環從斜麵上挑取2～3環培養18～24h的枯草芽孢杆菌菌苔於試管中，並充分混勻打散，製成濃稠的菌液。
(2)加5%孔雀綠水溶液2～3滴於小試管中，用接種環攪拌使染料與菌液充分混合。
(3)將此試管浸於沸水浴(燒杯)中，加熱15～20min。
(4)用接種環從試管底部挑數環菌於潔淨的載玻片上，並塗成薄膜，將塗片通過微火3次固定。
(5)水洗，至流出的水中無孔雀綠顏色為止。
(6)加沙黃水溶液，染2～3min後，傾去染液，不用水洗，直接用吸水紙吸幹。
(7)幹燥後用油鏡觀察。芽孢綠色，菌體紅色。
(二)莢膜染色法
1．石炭酸複紅染色
（1）取培養了72h的褐球固氮菌製成塗片，自然幹燥(不可用火焰烘幹)。
（2）滴入1～2滴95%乙醇固定(不可加熱固定)。
（3）加石炭酸複紅染液染色1～2min，水洗，自然幹燥。
(4) 在載玻片一端加一滴墨汁，另取一塊邊緣光滑的載玻片與墨汁接觸，再以勻速推向另一端，塗成均勻的一薄層，自然幹燥。
(5)幹燥後用油鏡觀察。菌體紅色，莢膜無色，背景黑色。
2．背景染色
(1)先加1滴墨水於潔淨的玻片上，並挑少量褐球固氮菌與之充分混合均勻。
(2)放一清潔蓋玻片於混合液上，然後在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸收多餘的菌液。
(3)幹燥後用油鏡觀察。背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現一明亮的透明圈即莢膜。
四、注意事項
1．莢膜染色塗片不要用加熱固定，以免莢膜皺縮變形。
2．供芽孢染色用的菌種應控製菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體上為宜。
五、實驗報告
(一)繪圖
1．枯草芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌的菌體及芽孢形態，芽孢的著生位置。
2．褐球固氮菌菌體及莢膜的形態。
(二)試製片，但不進行染色，觀察是否能看到芽孢和莢膜?
七、問題和思考
1．為什麽芽孢染色要加熱?為什麽芽孢及營養體能染成不同的顏色?
2．組成莢膜的成分是什麽?塗片一般用什麽固定方法，為什麽?
3．試設計實驗如何鑒定某一產芽孢菌株的芽孢形態、著生位置及所屬分類地位。
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