一、實驗目的和內容
目的：鞏固無菌操作技術，掌握細菌的塗片和單染色技術，了解口腔中的微生物及其觀察方法。
內容：1.學習細菌單染色操作技術。
2. 用單染色法或負染色法觀察口腔中的微生物。
二、實驗材料和用具
大腸杆菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylocosccus aureus)的斜麵菌種。
呂氏美藍染色液、石炭酸複紅染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、無菌水；
顯微鏡、擦鏡紙、接種環、酒精燈、載玻片、吸水紙、無菌牙簽。
三、操作步驟
(一)單染色法
1．塗片 在潔淨無脂的載玻片中央滴一小滴無菌水，用無菌操作方法從菌種斜麵挑取少量菌體與水滴充分混勻，塗成薄膜，塗布麵積約1～1.5cm2(圖7—1A、B)。
2．幹燥 將塗片於室溫中自然幹燥。
3．固定 手扶載片一端，使塗菌的一麵向上，將載片通過微火2～3次。在火上固定時，用手摸塗片反麵，以不燙手為宜。不能將載片在火上烤，否則細菌形態毀壞(圖7—1C)。
4．染色 將塗片置於水平位置，滴加染色液覆蓋於塗菌處，染色約2min（圖7—1D）
5．水洗 傾去染色液，斜置載片，用自來水的細水流由載片上端流下，不得直接衝在塗菌處，直洗至從載片上流下的水中無染色液的顏色為止（圖7—1E）。
6．幹燥 自然晾幹或用吸水紙輕輕地吸幹，注意不要擦掉菌體（圖7—1F）。
7．待標本完全幹燥後，先用低倍鏡和高倍鏡觀察，將典型部位移至視野中央，再用油鏡觀察。
(二)口腔微生物的觀察
1．單染色法
(1)在潔淨無油膩的載片中央滴一小滴無菌水，用牙簽取牙垢少許與水滴充分混勻，塗成薄膜。
(2)將塗片於室溫中自然幹燥後，按上麵單染色法的步驟，進行固定、染色、水洗，幹燥後鏡檢。
2．負染色法
(1)在潔淨無油膩的載片的一端滴一小滴無菌水，用牙簽取牙垢少許與水滴充分混勻，然後加少許黑色素溶液，充分混勻。
(2)另取一載片將其邊緣放在含菌載片的一端，然後推向另一端，則含菌載片上的混合液被推成薄膜。
(3)於室溫中自然幹燥。
(4)鏡檢：將光線調亮，先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察。
四、注意事項
載玻片要潔淨無脂，否則菌液塗不開。塗片時，滴水不要過多，挑菌量宜少，菌膜宜薄。
五、實驗報告
(一)繪圖
1．單染色後觀察到的大腸杆菌和金黃色葡萄球菌的形態圖。
2．你所觀察到的口腔微生物的形態圖，並注明使用的染色方法，菌體和背景的顏色。
(二)單染色法和負染色法操作要點。
七、問題和思考
1．塗片在染色前為什麽要先進行固定?固定時應注意什麽問題?
2．製備染色裝片時應注意哪些事項，為什麽?製片為什麽要完全幹燥後才能用油鏡觀察?
3．你知道口腔中通常存在哪些微生物嗎?如何進行區分?
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