顯微鏡油浸係物鏡的使用
一、實驗目的和內容
目的：複習顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術，了解油浸係物鏡的基本原理，掌握油浸係物鏡的使用方法。
內容：1．學習油浸係物鏡的使用方法。
2．用油鏡觀察枯草芽孢杆菌和金黃色葡萄球菌染色裝片。
二、實驗材料和用具
枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的染色裝片。
香柏油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙。
三、操作步驟
(一)觀察前的準備
1．將顯微鏡置於平穩的實驗台上，鏡座距實驗台邊沿約為4cm。坐正，練習用左眼觀察。
2．調節光源：將低倍物鏡轉到工作位置，把光圈完全打開，聚光器升至與載物台相距約1mm左右。轉動反光鏡采集光源，光線較強的天然光源宜用平麵鏡，光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹麵鏡，對光至視野內均勻明亮為止。觀察染色裝片時，光線宜強；觀察末染色裝片時，光線不宜太強。
(二)低倍鏡觀察染色裝片
首先上升鏡簡，將枯草芽孢杆菌染色裝片置於載物台上，用標本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方，物鏡降至距裝片0.5cm處，適當縮小光圈然後兩眼從目鏡觀察，轉動粗調節器使物鏡逐漸上升(或使鏡台下降)至發現物像時，改用細調節器調節到物像清楚為止。移動裝片，把合適的觀察部位移至視野中心。
(三)高倍鏡觀察
眼睛離開目鏡從側麵觀察，旋轉轉換器，將高倍鏡轉至正下方，注意避免鏡頭與玻片相懂。再由目鏡觀察，仔細調節光圈，使光線的明亮度適宜。用細調節器校正焦距使物鏡清晰為止。將最適宜觀察部位移至視野中心，繪圖。不要移動裝片位置，準備用油鏡觀察。
(四)油鏡觀察
1．提起鏡筒約2cm，將油鏡轉至正下方。在玻片標本的鏡檢部位(鏡頭的正下方)滴一滴香柏油。
2．從側麵注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴大為止，鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。
3．將光線調亮，左眼從目鏡觀察，用粗調節器將鏡筒徐徐上升(切忌反方向旋轉)，當視野中有物像出現時，再用細調節器校正焦距。如因鏡頭下降未到位或鏡頭上升太快末找到物像，必須再從側麵觀察，將油鏡降下，重複操作直至物像看清為止。仔細觀察並繪圖。
4．再次觀察 提起鏡筒，換上金黃色葡萄球菌染色裝片，依次用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察，繪圖。重複觀察時可比第一次少加香柏油。
(五)鏡檢完畢後的工作
1．移開物鏡鏡頭。
2．取出裝片。
3．清潔油鏡，油鏡使用完畢後，須用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯擦掉殘留的香柏油，最後再用幹淨的擦鏡紙擦幹殘留的二甲苯。
4．擦淨顯微鏡，將各部分還原。將接物鏡呈“八”字形降下，不可使其正對聚光器，同時降下聚光器，轉動反光鏡使其鏡麵垂直於鏡座。最後套上鏡罩，對號放入鏡箱中，置陰涼幹燥處存放。
四、注意事項
1．使用油鏡必須按先用低倍鏡和高倍鏡觀察，再用油鏡觀察
2．下降鏡頭時，一定要從側麵注視，切忌用眼睛對著目鏡，邊觀察邊下降鏡頭的錯誤操作，以免壓碎玻片而損壞鏡頭。
3．使用二甲苯擦鏡頭時，注意二甲苯不能過多，以防溶解固定透鏡的樹脂。
4．注意保持顯微鏡的潔淨，對金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。
五、實驗報告
分別繪出在高倍鏡和油鏡下觀察到的枯草芽孢杆菌及金黃色葡萄球菌的形態，注明物鏡放大倍數和總放大率。
六、問題和思考
1．用油鏡便於觀察細菌的依據是什麽？
2．使用油鏡應特別注意哪些問題？
3．當物鏡從低倍鏡轉到高倍鏡和油鏡時，對照明度有何要求？應如何調節？
油鏡的基本原理
（一）油鏡頭的辨認
油鏡頭上常刻有OI(oil immersion)或HI（homogeneneous immersion）字樣，有的還刻有一圈紅線或黑線標記，在低倍物鏡、高倍物鏡和油鏡3物鏡中，油鏡的放大倍數和數值孔徑（numerical aperture）最大，而工作距離最短（圖5—1）
（二）顯微鏡的分辨率
顯微鏡性能的優劣不單是看它的總放大倍數，更重要的是看它分辯率的大小。分辨率是指顯微鏡能分辨出物體兩點間最小距離（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值與光線的波長（λ）成正比，與物鏡的數值孔徑（NA）成反比。
從上式可看出，縮短光波長和增大數值孔徑都可提高分辨率。
數值孔徑指光線投射到物鏡上的最大角度（稱鏡口角，α）的一半正弦與介質折射率（n）的乘積；
影響數值孔徑大小的因數，一是鏡口角，二是介質的折射率。
當鏡與裝片之間的介質為空氣時，由於空氣（n= 1.52）的折射率不同，光線會發生折射，不僅使進入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會減少鏡口角（圖5—2A）。當以香柏油（n=1.515）為介質時，由於它的折射率與玻璃相近，光線經過載玻片後可直接通過香柏油進入物鏡而不發生折射（圖5—2B），不僅增加了視野的照明度，更重要的是通過增加數值孔徑達到提高分辨率的目的。可見光的波長平均為0.55μm。當使用數值孔徑為0.65的高倍鏡時，它能辨別兩點之間的距離為0.42μm；而使用數值孔徑為1.25的油鏡時，能辨別兩點之間的距離則為0.22μm。
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