1. 從瓊脂平板挑取形態相似的純培養菌落接種肉湯培養基，並於35度培養至濁度達到或超過0.5麥氏單位，取出用鹽水或肉湯調節菌液濃度至0.5麥氏單位，含菌量約（1－2）×108cfu/ml。也可將菌落直接懸浮於無菌鹽水或肉湯內，調至0.5麥氏單位，這稱為直接菌懸液法。
2. 用無菌棉拭子浸入調好的菌懸液中，將多於菌懸液在管壁擠出，在M-H瓊脂平皿上劃線，劃滿整個瓊脂表麵，旋轉平皿60°重複劃線共三次，最後一次用拭子塗抹瓊脂邊緣。置室溫3－5分鍾。
3.用紙片分配器或無菌鑷子取藥敏紙片，貼於平板表麵，並用鑷尖輕壓一下紙片，使其貼平。每張紙片的間距不小於24mm，紙片的中心距平板的邊緣不小於15mm，90mm直徑的平板適宜貼6張藥敏紙片。
4. 將貼好紙片的平板置35度孵育18－24h後，用遊標卡尺量取抑菌圈直徑。
根據抑菌圈的大小（不同抗生素其抑菌圈大小的標準不一致），判斷為敏感（S），耐藥（R）或中介度（I）。
某些細菌可蔓延生長至某種抗生素的抑菌圈內，如磺胺藥抑菌圈內可能有微量的細菌生長，可忽略不計，應以外圈為準。
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