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免疫磁珠捕獲與分離大腸埃希氏菌



錄入時間:2014-10-10 11:54:12 來源:國家食品風險評估中心

應按照生產商提供的使用說明進行免疫磁珠捕獲與分離。當生產商的使用說明與下麵的描述可能有偏差時,按生產商提供的使用說明進行。

將Eppendorff 管按樣品和質控菌株進行編號,每個樣品使用1 Eppendorff管,然後插入到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕振蕩E.coli O157 免疫磁珠溶液後,用開蓋器打開每個Eppendorff 管的蓋子,每管加入20μLE.coli O157 免疫磁珠懸液。

取mEC+n 肉湯增菌培養物1mL,加入到Eppendorff 管中,蓋上蓋子,然後輕微振蕩10s。每個樣品更換1 隻加樣吸頭,質控菌株必須與樣品分開進行,避免交叉汙染。

結合:在18℃~30℃環境中,將上述Eppendorff 管連同磁板架放DynalMX1 樣品混合器上轉動或用手輕微轉動10min,使E.coli O157 與免疫磁珠充分接觸。

捕獲:將磁板插入到磁板架中濃縮磁珠。在3min 內不斷地傾斜磁板架,確保懸液中與蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來,此時,在Eppendorff 管壁中間明顯可見圓形或橢圓形棕色聚集物。

吸取上清液:取1 支無菌加長吸管,從免疫磁珠聚集物對側深入液麵,輕

輕吸走上清液。當吸到液麵通過免疫磁珠聚集物時,應放慢速度,以確保免疫磁珠不被吸走。

免疫磁珠的滑落:某些樣品特別是那些富含脂肪的樣品,其磁珠聚集物易於滑落到管底。在吸取上清液時,很難做到不丟失磁珠,在這種情況下,可保留50μL~100μL 上清液於Eppendorff 管中。如果在後續的洗滌過程中也這樣做的話,脂肪的影響將減小,也可達到充分捕獲的目的。

洗滌:從磁板架上移走磁板,在每個Eppendorff 中加入1mL PBSTween20洗液,轉動磁板架3 次以上,洗滌免疫磁珠混合物。

免疫磁珠懸浮:移走磁板,將免疫磁珠重新懸浮在100μL PBS-Tween20 洗液中。

塗布平板

用漩渦混合器將免疫磁珠混勻,用加樣器各取50μL 免疫磁珠懸液分別轉移至CT-SMAC 平板和改良CHROMagar O157 顯色瓊脂平板一側,然後用無菌塗布棒將免疫磁珠塗布平板的一半,再用接種環劃線接種平板的另一半。待瓊脂表麵水分完全吸收後,翻轉平板,於36℃±1℃培養18h~24h

 

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