2005年版藥典三部部分附錄
1．無菌檢查法（修訂）
2．支原體檢查法（增修）
3．病毒外源因子檢查法（修訂）
4．熱原質檢查法（修訂）
5．細菌內毒素檢查法（修訂）
6．崩解時限檢查法（新增）
7．融變時限檢查法（新增）
8．最低裝量檢查法 （新增）
9．裝量（片重）差異檢查法（新增）
10．粒度檢查法 （新增）
11．抗毒素F（ab）2測定法（修訂）
12．絮狀單位測定法（新增）
13．A群腦膜炎球菌多糖疫苗多糖分子大小測定法（增修）
14．傷寒Vi多糖分子量大小測定法（新增）
15．乙醇殘留量測定法（康衛氏擴散皿法）（新增）
16．蛋白質含量測定（雙縮脲法）（新增）
無菌檢查法
無菌檢查法係指用微生物培養法檢查生物製品是否無菌的一種方法。
無菌檢查應在潔淨度為10000級環境中的局部潔淨度100級、單向流空氣區域內或無菌隔離係統中進行，其全過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物汙染。單向流空氣區、工作台麵及無菌隔離係統必須進行潔淨度驗證。
各種生物製品的無菌檢查，均應按照本附錄的規定進行，有專門規定者除外。
1 儀器
1.1 取樣用滅菌注射器，5、10ml(供直接接種法用)。
1.2 全封閉式集菌培養器，濾膜孔徑不大於0.45μm，膜直徑約50mm （供薄膜過濾法用）。
1.3 普通顯微鏡（細菌鏡檢用）。
2 培養基及其製備方法
培養基應適合需氧菌、厭氧菌或真菌的生長，可按以下處方製備，亦可使用按該處方生產的符合規定的幹粉培養基。
2.1 需氧菌、厭氧菌培養基1（流體硫乙醇酸鹽1，用於培養需氧菌、厭氧菌）
胰酪蛋白腖(或酪素胰酶消化液，以總氮計2000mg) 15g
酵母浸出粉(或酵母透析液200ml) 5g
葡萄糖 5g
氯化鈉 2.5g
L-胱氨酸(或半胱氨酸鹽酸鹽) 0.5g
硫乙醇酸鈉(或硫乙醇酸) 0.5g（0.3ml）
瓊脂 0.65～0.75g
刃天青 0.01g
水 1000ml
除葡萄糖和刃天青外，取上述成分加入水中，微溫溶解後，調節pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青，搖勻，調節pH值使滅菌後為7.1±0.2。
在供試品接種前，培養基氧化層的顏色（紅色）不得超過培養基深度的1/3，否則，須經水浴煮沸加熱20分鍾，迅速冷卻。隻限加熱一次，並防止被汙染。
2.2 需氧菌、厭氧菌培養基2 (流體硫乙醇酸鹽培養基2)
按需氧菌、厭氧菌培養基1處方，刪除瓊脂，取其餘成分，如法配製，即得。
2.3改良馬丁培養基（用於培養需氧菌、真菌）
蛋白腖 5g
酵母浸出粉 (或酵母透析液200ml) 2g
葡萄糖 20g
磷酸氫二鉀 1g
硫酸鎂 (MgSO4 ·7H2O) 0.5g 水 1000 ml
0.1%虎紅 2 ml
除葡萄糖外，取上述成分加入水內，微溫溶解後，調節pH值約為6.8，煮沸，加葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌後為6.4±0.2。
2.4 營養瓊脂培養基
蛋白腖 10g
牛肉浸粉 5g
氯化鈉 5g
瓊脂 14g
水 1000ml
取上述成分加入水中，微溫溶解後，調節pH值為弱堿性，煮沸，濾清，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2。
上述培養基一般分別按10 ml、40 ml、100 ml或200 ml分裝於試管或其他容器中，裝量為試管或容器高度的2/5，均以115℃滅菌30分鍾。細菌培養基經30-35℃培養3天，改良馬丁培養基經20-25℃培養3-5天後，應無菌生長。合格的培養基使用期限不得超過一周。
3 培養基靈敏度檢查
3．1 菌種 由國家藥品檢定機構分發。
3.1.1 需氧菌 乙型溶血性鏈球菌(CMCC 32210株)，短芽孢杆菌(7316株)。
3.1.2 厭氧菌 生孢子梭狀芽孢杆菌(CMCC 64941株)。
3.1.3 真菌、白色念珠菌（ATCC 10231）
3．2 菌液製備
將乙型溶血性鏈球菌、生孢子梭狀芽孢杆菌、短芽孢杆菌分別接種於被檢的培養基，經30～35℃培養一定時間 (乙型溶血性鏈球菌和生孢子梭狀芽孢杆菌培養24～48小時，短芽孢杆菌培養18～20小時)後，將乙型溶血性鏈球菌和短芽孢杆菌分別刮入0.9%無菌氯化鈉溶液內製成均勻菌液；生孢子梭狀芽孢杆菌先將菌液吸入滅菌的試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液製成均勻菌液；白色念珠菌接種在改良馬丁培養基上，置20～25℃培養2-3天後，刮入0.9%無菌氯化鈉溶液製成均勻菌液。再將以上菌液稀釋至與標準比濁管（由國家藥品檢定機構分發）相同之濃度，然後用0.1%蛋白腖水作10倍係列稀釋， 分別製成10-8乙型溶血性鏈球菌菌液，10-7的短芽孢杆菌菌液、10-7生孢子梭狀芽孢杆菌菌液及10-6白色念珠菌菌液。
3.3 培養基接種
將10-7的短芽孢杆菌、10-7生孢子梭狀芽孢杆菌、10-8乙型溶血性鏈球菌和10-6 白色念珠菌菌液各1 ml分別接種到每管9 ml被檢培養基中，(用於厭氧菌的培養基在試管中裝量高度不得低於7cm)。每種菌液至少接種3管，並用未接種的培養基做對照，將接種乙型溶血性鏈球菌、生孢子梭狀芽孢杆菌的培養基置30～35℃培養3天，接種短芽孢杆菌的培養基置30～35℃培養5天，接種白色念珠菌的培養基置20～25℃培養5天，記錄結果。
3.4 結果判定
接種後培養基管數有2/3以上呈現生長，則判為該培養基的靈敏度合格。
培養基靈敏度：乙型溶血性鏈球菌(32210株)應達到10-8，短芽孢杆菌(7316株)和生孢子梭狀芽孢杆菌(64941株)應達到10-7，白色念珠菌（ATCC 10231 株）應達到10-6。
3．5 附注
3.5.1 不應在同一潔淨室內同時操作兩個菌株。
3.5.2 無菌檢查用培養基應每批進行靈敏度檢查，合格後方可使用。
3.5.3 各生產單位的質量檢定部門應定期抽檢無菌檢查用培養基的靈敏度。國家藥品檢定機構應定期抽檢各生產單位的無菌檢查用培養基。
4 各種培養基的采用
4.1 檢查需氧性和厭氧性雜菌，應采用流體硫乙醇酸鹽培養基。檢查不含汞類防腐劑製品中的需氧性和厭氧性雜菌時，該培養基中可不加硫乙醇酸鹽。
4.2 檢查真菌和腐生菌時，應采用真菌培養基。
4.3 檢查混濁製品時，可采用不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養基。檢查活疫苗時，可適當增加瓊脂含量，做成斜麵。
5 抽樣量及抽檢瓶數
5.1 原液及半成品
除半成品除菌後需立即分裝、留樣作無菌檢查的製品外，原液及半成品應每瓶（罐）分別進行無菌檢查，其抽樣量應至少為0.1%，但不得少於10ml。原液及半成品每開瓶一次，應如上法抽驗。體外用診斷製品半成品每批取樣至少3ml。
5.2 成品
每亞批均應進行無菌檢查，供試品應隨機抽取，應具有代表性(包括分裝過程的前、中、後供試品或凍幹過程不同層凍幹櫃中的供試品)。成品抽驗量分出廠製品抽驗量和上市製品監督抽驗量兩種。
5.2.1 出廠製品抽驗量
5.2.1.1 分裝量在100支(瓶)或以下者抽檢不少於5支，101～500支(瓶)者抽檢不少於10支(瓶)，501～10000支(瓶)者抽檢不少於20支(瓶)，10001支(瓶)以上者抽檢40支(瓶)。
5.2.1.2 每瓶裝量在20ml以上的凍幹血液製品，每櫃凍幹200瓶以下者抽檢2瓶，200瓶及以上者抽檢4瓶。每瓶裝量6～20ml抽檢數量加倍。5ml和5ml以下者按5.2.1.1項抽檢。
5.2.2 上市製品監督抽驗量
5.2.2.1 除血液製品外，其他生物製品每批抽檢8支(瓶)。
5.2.2.2 血液製品每瓶裝量在50ml以下，抽檢6瓶，50ml或50ml以上抽2瓶。
表 每支(瓶)注射劑抽驗量
每支(瓶)製品裝量
(ml)
＜0.5
0.5≤V＜5
5≤V＜20
20≤V＜100
每支(瓶)抽驗量
(ml)
全量
0.5
1.0
5.0
6 檢查法
無菌檢查法包括直接接種法及薄膜過濾法。如供試品性狀允許，可優先采用薄膜過濾法。
6．1 直接接種法
6.1.1 含防腐劑的製品，應先增菌。按5. 2項抽取的供試品按上表逐瓶取樣，並按每20支安瓿混合後接種。應接種培養基瓶數依供試品混合量（全部接種）而定。接種量與培養基的比例：用苯酚或氯仿作防腐劑者至少為1∶20，用汞作防腐劑者或製品內含有甲醛、抗生素者至少為1∶50。將混合供試品先按此比例接種於流體硫乙醇酸鹽培養基1 內增菌，增菌培養基不得少於200ml（扁瓶）。於20～25℃培養3～4天後移種至流體硫乙醇酸鹽培養基1、適宜的營養瓊脂斜麵、改良馬丁培養基各2管，每管0.5 ml。將流體硫乙醇酸鹽培養基1、適宜的營養瓊脂斜麵各1管置30～35℃培養，其餘各管置20～25℃培養，增菌管及移種管培養時間全程不得少於14天。
6.1.2 不含防腐劑製品，不經增菌。按5.2項及上表將每批（或亞批）抽檢供試品逐瓶取樣混合，裝量在5.0ml以下者(包括5.0ml)每10瓶（安瓿）混合，裝量在5.0ml以上者每7瓶（安瓿）混合，應接種培養基管數依供試品混合量（全部接種）而定。將混合後的供試品直接接種於流體硫乙醇酸鹽培養基1及改良馬丁培養基培養基，接種後的流體硫乙醇酸鹽培養基總數的1/2置30～35℃培養，其餘置20～25℃培養，同時以0.9%無菌氯化鈉溶液代替供試品，做陰性對照，培養時間不得少於14天。
6.1.3 供試品混濁和接種後不能判定結果的製品，可按上表取規定量的供試品，接種於流體硫乙醇酸鹽培養基2 (200ml)內進行增菌培養，3～4天後移種。培養基種類和管數、培養溫度同6.1.1項，增菌管及移種管培養時間全程不得少於14天，然後判定結果。
6.1.4 體外診斷製品
隻做半成品無菌檢查。即半成品在加防腐劑之前，除菌過濾時留樣做無菌檢查，用直接接種法，培養8天，觀察結果。如有菌生長，製品需經除菌處理後再做無菌檢查，若再有菌生長應廢棄。如半成品已加入防腐劑後除菌，則應留樣按含防腐劑製品用直接接種法作無菌檢查。
6．2 薄膜過濾法
采用全封閉式集菌器，薄膜孔徑不大於0.45μm，膜直徑約50mm。
取規定抽檢供試品數，（如供試品少於10ml，則先用100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液或無菌稀釋液稀釋，）立即在無菌條件下導入無菌薄膜過濾器內，加壓或減壓過濾。含汞類防腐劑的供試品，在供試品過濾後，用0.9%無菌氯化鈉溶液或其他適宜的無菌溶劑衝洗濾膜3次，每次100ml。過濾後，兩個濾器加流體硫乙醇酸鹽培養基1 各100ml，另一個濾器加改良馬丁培養基100ml。一個硫乙醇酸鹽培養基的濾器置30-35℃培養，其餘置20-25℃培養，同時以0.9%無菌氯化鈉溶液代替供試品做陰性對照。培養時間不少於14天。
6.3 結果判定
6.3．1 無菌生長判為合格(有專門規定者除外)。
6.3.2 發現有菌生長，可複試。複試供試品量應加倍，無菌生長判為合格。若複試仍有菌生長，該製品判為不合格。
6.3.3 成品無菌檢查不合格的亞批數占整批的30%以上時，由質量保證部門會同有關部門根據具體情況，全部或部分廢棄。
附注：凍幹製品應按使用說明書或標簽規定的溶解液重溶後進行無菌檢查。
修訂說明：此附錄在現行版‘無菌試驗規程’的基礎上，參考《中國藥典》‘無菌檢查法’及WHO相關規程進行了修訂，並對全文進行了重新組合。原規程中‘支原體檢查’部分另寫成為獨立的附錄。
支原體檢查
本法係采用培養法和指示細胞法（DNA染色法）對主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子批、對照細胞以及臨床治療用細胞進行支原體檢查，上述兩種方法應同時進行。病毒類疫苗的病毒收獲液、原液或成品的支原體檢查采用培養法，必要時，亦可采用指示細胞法篩選培養基。也可采用經國家藥品檢定機構認可的其他方法。
1 培養法
1． 1 儀器
適宜規格的培養箱
普通顯微鏡
1．2 培養基種類及處方
1．2．1 肺炎支原體肉湯培養基
豬胃消化液 500ml
牛肉浸液 500ml
酵母浸粉 5 g
氯化鈉 2.5g
葡萄糖 5g
酚紅 0.02g
將上述成分混合溶解，於121℃高壓滅菌15分鍾。使用時，於80ml內加入：
青黴素G溶液(10萬U/ml) 1.0ml
1%醋酸鉈溶液 2.0ml
無支原體馬血清 20ml
最終pH值 7.6±0.2
1．2．2 精氨酸支原體肉湯培養基
豬胃消化液 500ml
牛肉浸液 500ml
酵母浸粉 5 g
氯化鈉 2.5g
葡萄糖 5g
L-精氨酸 2g
酚紅 0.02g
將上述成分混合溶解，於121℃高壓滅菌15分鍾。使用時，於80ml內加入：
青黴素G溶液(10萬U/ml) 1.0ml
1%醋酸鉈溶液 2.0ml
無支原體馬血清 20ml
最終pH值 7.1±0.2
1．2.3 支原體半固體培養基
將2.1.1.1培養基中酚紅去掉，加入3g瓊脂即為半固體培養基。
1．2．4 支原體瓊脂培養基
將2.1.1.1培養基中酚紅去掉，加入13-15g瓊脂即為支原體瓊脂培養基。
1．3 支原體檢查用培養基靈敏度檢查（變色單位試驗法）
1．3．1 菌種
肺炎支原體(ATCC 1533株)，口腔支原體(ATCC 23714株)。由國家藥品檢定機構分發。
1．3．2 培養基
凡應用於檢查支原體的培養基都應進行變色單位試驗。
1．3．3 操作
凡操作支原體應在專門的無菌操作室內進行。
將菌種接種於被檢的支原體培養基，經35～37℃培養至培養基變色，盲傳兩代後，將培養物接種到被試培養基中，作10倍係列稀釋，肺炎支原體稀釋至10-7～10-9，接種在肺炎支原體肉湯培養基內；口腔支原體稀釋到10-3～10-5 ，接種在精氨酸支原體肉湯培養基內，每個稀釋度3支試管，置35～37℃培養7～14天觀察培養基變色結果。
1．3. 4 結果判定
以接種稀釋後培養基管數的2/3以上呈現生長變色的最高稀釋度為變色單位判定標準。
培養基的靈敏度：肺炎支原體(ATCC1533株)變色單位應達到10-8，口腔支原體(ATCC23714株)應達到10-4。
附注：質量檢定部門應會同培養基製造部門定期抽檢支原體培養基靈敏度。
1．4 供試品檢查
1．4．1 抽樣量
按“無菌檢查法”進行。應對半成品按亞批抽樣檢查，成品可不再做。
1． 4. 2 方法及步驟
供試品如在24小時以內進行支原體檢查者可貯存於2～8℃；超過24小時才能接種者，供試品應在-20℃以下貯存。
檢查支原體采用支原體半流體和液體培養基。半流體培養基在使用前煮沸10～15分鍾，冷卻至56℃左右，加入未滅活馬血清或滅活小牛血清和酵母浸液(培養基∶血清∶酵母浸液為7∶2∶1)，並可酌情加入適量青黴素或醋酸鉈，充分搖勻。液體培養除無需煮沸外亦應同樣補加上述成分。
將供試品0.5～1.0ml分別種入每支10ml半流體(已冷至35～37℃)和10ml液體培養基中，每種培養基接種4支，置35～37℃培養21天。於接種後的第7天取4支中的2支進行次代培養，每一培養基轉種半流體及液體培養基各2支，置35～37℃下培養21天，每隔3天觀察一次。
1.4.3 結果判定
在培養結束時，如已接種的培養基均無支原體生長，則供試品為合格；如有支原體生長，可用兩倍的接種量和培養基進行重試，如無支原體生長，供試品為合格，如仍有支原體生長，供試品判為不合格。
2．指示細胞培養法(DNA染色法)
供試品接種於指示細胞(無汙染的Vero細胞或經國家藥品檢定機構認可的其他細胞)培養後，用特異熒光染料染色。如供試品汙染支原體，則附在細胞表麵的支原體DNA著色，在熒光顯微鏡下可判定。
2．1 儀器
適宜規格的熒光顯微鏡
適宜規格的二氧化碳孵箱
六孔細胞培養板或其他容器
2．2．培養基及指示細胞
DMEM完全培養基
DMEM無抗生素培養基
指示細胞（已證明無支原體汙染的Vero細胞或其他傳代細胞）
2．3 試劑
2..3.1 二苯甲酰胺熒光染料（Hoechst 33258）濃縮液：
稱取5 mg二苯甲酰胺熒光染料加入100 ml 不含酚紅和碳酸氫鈉的 Hank’s平衡鹽溶液中，在室溫下用磁力攪拌30～40分鍾，使完全溶解，避光-20℃保存。
2.3.2 二苯甲酰胺熒光染料工作液
取1 ml上述濃縮液，加至100ml無酚紅和碳酸氫鈉的Hank’s溶液中。
2.3.3 固定液
乙酸:甲醇（1:3）溶液為細胞固定液。
2.3.4 封片液
0.1mol/L檸檬酸 22.2ml
0.2mol/L Na2HP4·12H2O 27.8ml
甘油 50.0ml
以上三者混勻，調pH 至5.5。
2. 4供試品檢查
2.4.1 供試品的處理
2.4.1.1 細胞培養物：將待檢細胞經無抗生素培養基傳三代，然後取細胞已長滿的且三天未換液的細胞培養上清液，待檢。
2.4.1.2 毒種懸液：如該毒種對指示細胞可形成病變並影響結果判定時，應用對支原體無抑製作用的特異抗血清中和病毒後或用不產生細胞病變的另一種指示細胞進行檢查。
2.4.1.3 其他供試品：應選用該供試品對細胞生長無影響的細胞作為指示細胞進行檢查。
2.4.2 指示細胞的製備
取成片Vero細胞消化後，製成1 x105個/ml的細胞懸液，每孔0.5ml接種6孔細胞培養板或其他容器，每孔加無抗生素培養基3 ml，於5% 二氧化碳孵箱 37℃培養過夜。
2. 4. 3 方法及步驟
於指示細胞培養板中依次加供試品、陰性對照及陽性對照包括；
陰性對照加無抗生素培養基2ml；
陽性對照可選已知陽性的供試品標準菌株；
待檢細胞培養上清液2ml；
或毒種或其他供試品至少1ml。
5% 二氧化碳孵箱 37℃培養3～5天。
指示細胞培養物至少傳代1次；末次傳代培養用含蓋玻片的6孔培養板培養3～5天。
取出培養板，吸出培養孔中的培養液，加入固定液5ml，放置5分鍾。
吸出固定液，再加5ml固定液固定10分鍾。
吸出固定液，使蓋玻片在空氣中幹燥。
加 Hoechst 33258 染料（或其他DNA染料）工作液5ml，加蓋，室溫下放置30分鍾。
吸出染液，每孔加5 ml 蒸餾水，洗3次。
吸出蒸餾水，蓋玻片於空氣中幹燥。
取潔淨載玻片加封片液一滴，分別將蓋玻片麵向下蓋在封片液上製成封片。用熒光顯微鏡觀察。
2. 4. 4 結果判定
2.4.4.1 陰性結果：僅見指示細胞的細胞核呈現黃綠色熒光。
2.4.4.2 陽性結果：熒光顯微鏡下細胞外可見大小不等、不規則的熒光著色顆粒。
當陰性及陽性對照結果均成立時，試驗有效。
如未證明供試品有支原體存在，則供試品為合格；如發現供試品為陽性或可疑時，應進行重試；如仍陽性時，供試品判為不合格。
修訂說明：此附錄在現行版‘無菌試驗規程’的基礎上，參考WHO相關規程進行了修訂，並對全文進行了重新組合，並成為獨立附錄。
病毒外源因子檢查法
病毒類製品在毒種選育和生產過程中，經常使用動物或細胞培養基質，所以，有可能造成外源因子（特別是外源病毒因子）的汙染。為了保證產品質量，需要對毒種和細胞進行外源因子的檢測。
A. 病毒種子批外源因子檢查
對病毒主種子批或工作種子批，應取樣進行病毒外因子檢測，其取樣量應足夠檢測試驗的需要。在試驗前應用非人和非猴源的特異性抗體，中和本病毒。所用抗體應用與生產疫苗（或製品）不同種的無外源因子汙染的細胞（或動物）製備的免疫原生產的抗血清（或單克隆抗體）。如果病毒曾在禽類組織或細胞中繁殖過，則抗體不能用禽類來製備。若用雞胚，應來自SPF雞群。
1. 動物試驗法
1.1小鼠。取15~20g小鼠至少10隻，用經中和後的病毒懸液，每隻腦內接種0.03ml，腹腔接種0.5ml。至少觀察21天。解剖所有在試驗24小時後死亡或有患病體征的小鼠，為了檢查病毒感染的證據，直接肉眼觀察其病理改變，並將有病變的相應的組織懸液通過腦內和腹腔接種另外至少5隻小鼠並觀察21天。如果沒有小鼠表現出病毒感染現象，則病毒種子批符合要求。在觀察期內至少有80%最初接種的小鼠存活試驗才有效。
1.2乳鼠。出生後24小時以內的乳鼠，至少10隻，用經中和後的病毒懸液，腦內接種0.01ml，腹腔接種至少0.1ml。每天觀察，至少14天。解剖所有在試驗24小時後死亡或有患病體征的小鼠，直接肉眼觀察其病理改變，並取有病變的相應的組織和腦、脾製備成懸液腦內和腹腔接種另外至少5隻小鼠並每天觀察，觀察14天。如果沒有小鼠表現出有病毒感染現象，該種子批通過試驗。在觀察期內至少有80%最初接種的小鼠存活試驗才有效。
2. 細胞培養法
2.1非血吸附病毒檢查
中和後的病毒懸液，還應分別接種於人源、猴源和生產用的同種不同批的細胞。如果是利用人二倍體細胞生產的，還應接種另外一株人二倍體細胞。每種細胞最少接種6瓶，每瓶病毒懸液接種量不少於培養液總量的25%。於36±1℃培養，觀察二周，或最後一次收獲病毒液時間檢查是否有CPE出現。未見CPE為陰性。
2.2血吸附病毒檢查
於第6~8天和第14天，每種細胞分別各取出2瓶進行血吸附病毒檢查。用0.2%~0.5%豚鼠紅細胞懸液覆蓋於細胞表麵，一瓶放2~8℃，一瓶放20~25℃，30分鍾後顯微鏡下觀察，未見血球吸附現象為陰性。
3.雞胚檢查法
在禽類組織或細胞中繁殖過的病毒種子需用雞胚檢查禽類病毒的汙染。選用9~11和5~7日齡SPF雞胚最少每組5隻，分別於尿囊腔和卵黃囊途徑接種每胚0.5ml經過中和後的病毒懸液。孵育7日後，取尿囊液用豚鼠和雞紅細胞做血球凝集試驗應為陰性。被接種的雞胚至少80%存活7天試驗有效。
B. 生產用對照細胞外源因子檢查
1.非血吸附病毒檢查
1.1細胞直接觀察
每批生產用細胞應留取5%（不少於500ml），分種於若幹培養瓶中，加入與疫苗生產相同的細胞維持液，在與疫苗生產相同的條件下培養，觀察14天，在顯微鏡下觀察，是否有CPE出現，無CPE出現者為陰性。在觀察期末至少要80%的對照細胞培養物存活試驗成立。
1.2細胞培養試驗
對照細胞在觀察期末，收取上清液混合後取適量接種於猴源和人源的細胞培養物，如果疫苗病毒在非猴或非人源其他細胞係上生產，還應接種於同種不同批細胞。接種量應不少於總量的25%。每種細胞至少檢查5ml上清混合液。在36±1℃培養，如生產的細胞培養條件不是36±1℃，則應選用與生產相同的培養條件進行。並連續觀察14天，或最後到收獲液的時間仍無CPE者為陰性。
2.血吸附病毒檢查
對1.1、1.2細胞培養物在觀察期末取至少25%的細胞培養瓶進行血吸附病毒檢查。（方法見A.2.2項）
修訂說明：此規程根據歐洲藥典（2000版）修訂。
熱原質檢查法
本法係將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內，在規定時間內，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規定。
1 供試用家兔
1.1 供試用的家兔應健康合格，體重1.7~2.5kg, 雌兔應無孕。
1.2 預測體溫前7日即應用同一飼料飼養，在此期間內，體重應不減輕，精神、食欲、排泄等不得有異常現象。
1.3 未曾用於熱原質試驗的家兔，應在檢查供試品前3~7日內預測體溫,進行挑選。挑選試驗的條件與檢查供試品時相同，僅不注射藥液，每隔30分鍾測量體溫1次，共測8次，8次體溫均在38.0~39.6℃的範圍內,且最高與最低體溫差不超過0.4℃的家兔,方可供熱原質試驗用。
1.4 凡熱原質試驗用過的家兔，若供試品判為符合規定，家兔至少休息48小時後可重複使用。對血液製品、抗毒素和其他同一過敏原的供試品在5天內可重複使用。
2 試驗前準備
2.1 試驗用的注射器、針頭及一切與供試品接觸的器皿，應置烘箱中用250℃加熱30分鍾或用180℃加熱2小時，也可用其他適宜方法除熱原質。
2.2 測溫探頭的精密度應為±0.1℃。探頭插入肛門的深度和時間各兔應相同，深度一般約6cm，時間不得少於2分鍾。
2.3 熱原質試驗前1~2日，供試驗用家兔應盡可能處於同一溫度的環境中，實驗室和飼養室的溫度相差不得大於5℃，實驗室溫度應在17～25℃，試驗全過程室溫變化不得大於3℃，並應保持安靜，避免強光照射，避免引起動物騷動（包括噪聲幹擾）。空氣中氨含量應低於20mg/L。
3 試驗
3.1 供試品
供試品或稀釋供試品的無熱原質注射液，在注射前應預熱至38℃。供試品的注射劑量見各製品規程的規定。但家兔每1kg體重注射體積不得少於0.5ml，不得大於10ml。
3.2 每批供試品初試用3隻家兔，複試用5隻家兔。
3.3 家兔在試驗前至少2小時開始停止給食並置於適宜裝置中，直至試驗完畢。家兔固定30～60分鍾後開始檢溫，間隔30分種測量體溫1次，一般測量2次，兩次體溫之差不得超過0.2℃,以此兩次體溫的平均值作為該兔的正常體溫。當日使用的家兔，正常體溫應在38.0℃~39.6℃的笵圍內,同組兔間正常體溫之差不得大於1℃。
3.4 測定其正常體溫後15分鍾以內，自耳靜脈緩緩注入規定劑量並預熱至38℃的供試品溶液，然後每隔30分鍾測量其體溫一次，連測6次。
3.5 若第6次較第5次升溫超過0.2℃並超過正常體溫時，應連續測量，直至與前一次相比升溫不超過0.2℃。
4 結果判定
每隻兔的正常體溫與注射供試品後最高升溫之差，為該兔的應答。出現負值以零計算。
4.1 初試結果判定
4.1.1 符合下列情況者，判為合格：
3隻家兔體溫升高均低於0.6℃,並且3隻家兔體溫升高總和不超過1.4℃。
4.1.2 有下列情況之一者，複試一次：
3隻家兔中，有1隻家兔體溫升高0.6℃或0.6℃以上；或3隻家兔體溫升高總和超過1.4℃。
4.2 複試結果判定
4.2.1 符合下列情況者，判為合格：
初、複試的8隻家兔中,2隻或2隻以下家兔體溫升高0.6℃或0.6℃以上，並且升溫總和不超過3.5℃。
4.2.2 有下列情況之一者，判為不合格：
初、複試8隻家兔中，2隻以上家兔體溫升高0.6℃或0.6℃以上；或在初試、複試合並8隻家兔的體溫升高總和超過3.5℃。
熱原質檢查法修訂說明
參考《中國藥典》二部附錄Ⅺ D《熱原檢查法》對《生物製品熱原質試驗規程》做如下修訂：
1、題目修訂
《生物製品熱原質試驗規程》→《熱原質檢查法》（同《中國藥典》二部）；
1、試驗用的家兔
1.1項 試驗用家兔的體重未變：1.7～2.5 kg；
1.3項 予檢溫時間：1～3日→3～7日（同《中國藥典》二部）；
1.3項 檢溫間隔時間：60分鍾，共測4次體溫→30分鍾，共測8次體溫（同《中國藥典》二部）；
1.3項 各兔最高與最低溫度差異：38.0～39.8 ℃→38.0～39.6 ℃；
1.3項 “最高與最低體溫差不超過0.5 ℃”→“最高與最低體溫差不超過0.4℃”；
2、試驗前準備
2.2項 增加“探頭插入肛門的深度和時間各兔應相同，深度一般約6cm，時間不得少於1分鍾。” （同《中國藥典》二部）；
2.3項 增加“實驗室和飼養室的溫度相差不得大於5℃”
2.3項 “避免噪聲幹擾”→“避免引起動物騷動（包括噪聲幹擾）”（參考〈歐洲藥典〉）；
3、試驗
3.3項 “家兔在試驗前2小時以上開始停止給食……”→“家兔在試驗前至少2小時開始停止給食……” ；
3.3項 檢溫“間隔30～60分鍾”→“間隔30分鍾”；
3.3項 增加“當日使用的家兔，正常體溫應在38.0℃~39.6℃的笵圍內,” 的要求（同《中國藥典》二部）。
4、結果判定
維持生物製品規程的表達方式。溫度的有效數字位數與《中國藥典》二部一致：小數點後一位。
5、保留生物製品熱原質試驗的特色和我們的經驗，如家兔使用次數，注射供試品的體積限製，實驗室的溫度等。
表：生物製品熱原質試驗規程修訂情況
《中國藥典》
二部
生物製品規程
《中國藥典》
三部
修訂理由
1.1家兔體重（kg ）
1.7～3.0
（中年兔）
1.7～2.5
1.7～2.5
注射量問題
1.7～2.5 kg的家兔為青年兔；敏感；
1.3予檢溫時間
試驗前3～7日
試驗前1～3日
試驗前3～7日
2周內無變化，與〈中國藥典〉二部一致。
1.3檢溫間隔時間
30分鍾，共測8次體溫
60分鍾，共測4次體溫
30分鍾，共測8次體溫
試驗更精細，與〈中國藥典〉二部一致
1.3予檢溫各兔體溫範圍
38.0～39.6 ℃
38.0～39.8 ℃
38.0～39.6 ℃
與〈中國藥典〉二部一致
1.3予檢溫各兔最高與最低溫度差異
不超過0.4 ℃
不超過0.5 ℃
不超過0.4 ℃
家兔體溫波動小，家兔穩定 。
2.2探頭插入肛門的深度和時間
各兔應相同，深度一般約6cm，時間不得少於1分鍾。
無要求
各兔應相同，深度一般約6cm，時間不得少於1分鍾。
應該有要求，與〈中國藥典〉二部一致。
2.3實驗室和飼養室的溫度差
不得大於5℃
無要求
不得大於5℃
嚴格試驗條件，與〈中國藥典〉二部一致。
2.3實驗室溫度
17℃～28℃
15℃～25℃
15℃～25℃
室溫超過28℃家兔不長體重；
USP規定：20～23℃；
2.3噪聲幹擾
避免噪音幹擾
噪聲幹擾
避免引起動物騷動（包括噪聲幹擾）
參考〈歐洲藥典〉，此種表達方式更合理。
3.3試驗前檢溫時間間隔
30分鍾
30～60分鍾
30分鍾
可行並與〈中國藥典〉二部一致
3.3試驗當日家兔體溫之間差異
38.0℃~39.6℃
未提及
38.0℃~39.6℃
雖然在1.3項有要求，但此處在寫明更嚴緊，也與中國藥典〉二部一致。
4結果判定
初、複試結果合格積極不合格合並描述
初、複試結果合格積極不合格分開描述
初、複試結果合格積極不合格分開描述
無原則差異，保留以往習慣
4有效數字
小數點後一位
小數點後兩位
小數點後一位
體溫計精度要求±0.1℃，結果要求小數點後兩位不合理。修改後與〈中國藥典〉二部一致
細菌內毒素檢查法
本法係利用從鱟的變形細胞中提取的試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素。以判斷供試品中細菌內毒素的含量是否符合規定的一種方法。細菌內毒素檢查有兩種方法：凝膠法和光度測定法。後者包括濁度法和顯色基質法，係分別利用細菌內毒素在與鱟試劑形成凝膠過程中具有相關的濁度變化和兩者反應過程中產生的凝固酶能使特殊底物顯色的原理，從而定量測定細菌內毒素的方法。可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除有專門說明外，以凝膠法結果為準。
細菌內毒素的量用內毒素單位（EU）表示。
細菌內毒素國家標準品係自大腸杆菌提取精製而成，用於標定、複核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內毒素工作標準品的效價。
細菌內毒素工作標準品係以細菌內毒素國家標準品為基準標定其效價，用於試驗中鱟試劑靈敏度複核、幹擾試驗及設置的各種陽性對照。細菌內毒素工作標準品中每1ng細菌內毒素的效價應不小於2EU，不大於50EU。
細菌內毒素檢查用水係指與靈敏度為0.03EU/ml或更高靈敏度的鱟試劑在37±1℃條件下24小時不產生凝集反應的滅菌注射用水。用於細菌內毒素定量測定用的細菌內毒素檢查用水，內毒素的含量應小於0.005EU/ml。
試驗準備 試驗所用器皿需經處理，除去可能存在的外源性內毒素，常用的方法是250℃幹烤至少1小時，也可用其他確證不幹擾細菌內毒素檢查的適宜方法。如果要使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭，要使用標明無內毒素並且對試驗不幹擾的器械。試驗操作過程應防止微生物的汙染。
（注：在本章中，“管”的意思包括其他任何反應容器，如微孔板中的孔。）
供試品溶液的製備 某些供試品需進行複溶、稀釋或在水性溶液中浸提。對於過酸、過堿或本身有緩衝能力的供試品，需調節被測溶液（或其稀釋液）的pH值，一般要求供試品溶液的pH值在6.0~8.0的範圍內。可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產廠家推薦的適當的緩衝劑來調節pH值。酸或堿溶液要用檢查用水在除去內毒素的容器中進行配製。緩衝劑必須經過認證無內毒素和無幹擾因子。
內毒素限值的建立 藥品、生物製品的細菌內毒素限值（L）一般按以下公式確定：
L=K/M
式中L為供試品的細菌內毒素限值，以EU/ml，EU/mg或EU/U活性單位表示；
K為按規定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/（kg·h）表示。注射劑，K=5EU/（kg·h），其中放射性藥品注射劑，K=2.5EU/（kg·h），鞘內用注射劑，K=0.2EU/（kg·h）；
M為人用每公斤體重每小時最大劑量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U活性單位/（kg·h）表示，人均體重按60kg計算，注射時間不小於1小時，按1小時計算。
確定最大有效稀釋倍數（MVD）
最大有效稀釋倍數是供試品被允許的最大稀釋倍數，在此稀釋倍數下可進行內毒素限值的檢測。用以下公式來確定MVD：
MVD=CL/λ
式中 L為供試品的細菌內毒素限值；
C為供試品溶液的濃度。當L以EU/ml表示時，則C等於1.0ml/ml，當L以EU/mg或EU/u表示時，C的單位需為mg/ml或u/ml。
λ為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度（EU/ml），或是在光度檢測中所使用的標準曲線上最低的內毒素濃度。
方法一：凝膠法
凝膠法是通過鱟試劑可與內毒素產生凝集反應的原理來檢測或定量內毒素。在標準環境中，能夠使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度就是鱟試劑的標示靈敏度，用EU/ml表示。為了保證試驗的精確性和有效性，要先複核鱟試劑的靈敏度和完成幹擾試驗。
鱟試劑靈敏度複核 當使用新一批鱟試劑或試驗環境中發生了可能會影響檢驗結果的改變時，須進行鱟試劑靈敏度複核試驗。
根據鱟試劑靈敏度的標示值（λ）,將細菌內毒素國家標準品或細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鍾，然後製成2.0λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒鍾。取分裝了0.1ml鱟試劑溶液的10mm×75mm試管或複溶後的0.1ml/支規格的鱟試劑原安瓿，等體積加入內毒素標準溶液。每一個濃度平行做4管，同時在2管中加入0.1ml細菌內毒素檢查用水做為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻後，封閉管口，垂直放入37±1℃適宜恒溫器中，保溫60分鍾±2分鍾。
將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉180°時，管內凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（+）；凝膠不能保持完整並從管壁滑脫者為陰性，記錄為（-）。保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。
當最大濃度2.0λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性時，試驗方為有效。按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（λc）。
λc=lg-1（ΣX/4）
式中X為反應終點濃度的對數值（lg）。反應終點濃度是指係列遞減的內毒素濃度中最後一個為陽性結果的濃度。
當λc在0.5λ~2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）時，方可用於細菌內毒素檢查，並以λ為該批鱟試劑的靈敏度。
幹擾試驗 按表1製備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應為無可檢驗出的內毒素且不超過最大有效稀釋倍數（MVD）的溶液，操作按鱟試劑靈敏度複核項下。
表1.凝膠法幹擾試驗溶液的製備
溶液
內毒素濃度/加入內毒素的溶液
稀釋用液
稀釋倍數
所含內毒素的濃度
平行管數
A
無/供試品溶液
-
-
-
4
B
2λ/供試品溶液
供試品溶液
1
2λ
4
2
1λ
4
4
0.5λ
4
8
0.25λ
4
C
2λ/檢查用水
檢查用水
1
2λ
2
2
1λ
2
4
0.5λ
2
8
0.25λ
2
D
無/檢查用水
-
-
-
2
溶液A：準備進行檢查並且未檢出內毒素的供試品溶液
溶液B：幹擾試驗係列
溶液C：鱟試劑標示靈敏度的對照係列
溶液D：檢查用水做的陰性對照
隻有當溶液A和D的所有平行管都為陰性，並且溶液C的結果在鱟試劑靈敏度複核範圍內時，試驗方為有效。按下式計算溶液C的反應終點濃度的幾何平均值（Es）和用供試品溶液製成的內毒素溶液B的反應終點濃度的幾何平均值（Et）。
Es= lg-1（ΣXs/4）
Et= lg-1（ΣXt/4）
式中Xs、Xt分別為C溶液和B溶液的反應終點濃度的對數值（lg）。
當Es在0.5λ~2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）時，且當Et在0.5Es和2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）時，則認為供試品在該濃度下不幹擾試驗。如果供試品溶液在小於MVD的稀釋倍數下對試驗有幹擾，將供試品溶液進行不超過MVD的進一步的稀釋後，再重複幹擾試驗。使用更高靈敏度的鱟試劑並對供試品進行更大倍數的稀釋有可能排除幹擾。
幹擾也可通過其他適當的方法排除，如過濾、中和、透析或加熱處理等。為確保所選擇的處理方法可以有效的排除幹擾且不會使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行幹擾試驗。
當鱟試劑、供試品的來源、配方、生產工藝有變或當試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行幹擾試驗。
凝膠法檢查法
1）凝膠限量試驗
按表2製備溶液A、B、C、D。
表2凝膠限量試驗溶液的製備
溶液
內毒素濃度/添加了內毒素的溶液
平行管數
A
無/供試品溶液
2
B
2λ/供試品溶液
2
C
2λ/檢查用水
2
D
無/檢查用水
2
溶液A：供試品溶液
溶液B：供試品陽性對照
溶液C：陽性對照
溶液D：檢查用水做的陰性對照
使用稀釋倍數為MVD並且已經排除幹擾的供試品液來製備溶液A和B。溶液B和C含有相當於2λ濃度的標準內毒素。溶液D為檢查用水。
結果判斷 保溫60分鍾±2分鍾後觀察結果。隻有當供試品陽性對照溶液B和陽性對照溶液C的平行管都為陽性，陰性對照溶液D的平行管為陰性時，試驗方為有效。
當溶液A的兩個平行管都為陰性時，供試品溶液符合規定。當溶液A的兩個平行管都為陽性時，供試品不符合規定。當溶液A的兩個平行管中的一個為陽性另一個為陰性時需進行複試。在複試中，溶液A需做4支平行管，當所有平行管都為陰性時，供試品溶液符合規定。
凝膠半定量試驗
本方法是通過確定終點濃度來量化供試品溶液中的內毒素。按表3製備溶液A、B、C和D。
表3凝膠半定量試驗溶液的製備
溶液
內毒素濃度/加入內毒素的溶液
稀釋用液
稀釋倍數
所含內毒素的濃度
平行管數
A
無/供試品溶液
檢查用水
1
-
2
2
-
2
4
-
2
8
-
2
B
2λ/供試品溶液
1
2λ
2
C
2λ/檢查用水
檢查用水
1
2λ
2
2
1λ
2
4
0.5λ
2
8
0.25λ
2
D
無/檢查用水
-
-
-
2
溶液A：沒有超過MVD並且通過幹擾試驗的供試品溶液。用檢查用水進行2倍係列稀釋，從通過幹擾試驗的稀釋倍數開始再稀釋至1、2、4和8倍，但隨後的稀釋也不得超過MVD。
溶液B：含2λ濃度標準內毒素的溶液A（供試品陽性對照）。
溶液C：含2λ、λ、0.5λ和0.25λ濃度標準內毒素的檢查用水係列。
溶液D：檢查用水（陰性對照）
結果判斷 試驗必須符合以下三個條件方為有效
（1） 陰性對照溶液D的所有平行管為陰性
（2） 供試品陽性對照B的所有平行管為陽性
（3） 溶液C的終點濃度的幾何平均值在0.5λ~2λ之間。
用溶液A中每一係列平行管的終點稀釋倍數乘以λ，即算出每個係列的終點濃度，所有平行管的終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內毒素濃度（按“靈敏度的複核”中的公式）。如果試驗檢驗的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內毒素濃度時要將結果乘上稀釋倍數。
如果試驗中供試品溶液的結果都為陰性，則記錄內毒素濃度為小於λ（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記錄為小於λ×該供試品的最低稀釋倍數）。如果結果都為陽性，記錄內毒素的濃度為大於或等於最大的稀釋倍數乘以λ（例：在表3中，原始稀釋倍數×8×λ）。
當內毒素濃度小於規定的限值時，供試品符合要求。
方法二、光度測定法
光度測定法分為濁度法和顯色基質法。
濁度法是檢測濁度增長的光度試驗。根據檢測原理，可分為終點濁度法和動態濁度法。終點濁度法的原理是反應混合物中的內毒素濃度和其在孵育終止時的濁度（吸光度或透光率）之間存在著量化關係。動態濁度法是檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增長速度的方法。
顯色基質法是檢測鱟試劑與內毒素反應時從選定的顯色肽中釋放出的有色團。根據檢測原理，分為終點顯色法和動態顯色法。終點顯色法的基礎是反應混合物中的內毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的有色團的數量之間存在的量化關係。動態顯色法是檢測反應混合物的顏色到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測顏色增長速度的方法。
所有的光度測定試驗都要求在特定的儀器中進行，溫度一般為37±1℃。
為保證濁度和顯色試驗的精確性和有效性，要預先進行標準曲線的校驗試驗以及試驗溶液的幹擾試驗。當試驗環境中發生了任何可能會影響檢驗結果的改變時，試驗的有效性就要求重新檢驗。
校驗標準曲線的標準性 用標準內毒素配成溶液並製成至少3個濃度的稀釋液（稀釋度不得大於10），最低濃度不得低於所用鱟試劑的標示檢測限。每一稀釋步驟的混勻時間同細菌內毒素檢查法凝膠法的要求，每一濃度至少做3支平行管。同時要求做2支陰性對照。當陰性對照在反應時間內不發生反應，將全部數據進行線性回歸分析。
根據線性回歸分析，標準曲線的相關係數（r）的絕對值應大於或等於0.980，試驗方為有效。
光度技術的幹擾試驗 選擇標準曲線中點或一個靠近中間的內毒素濃度。按表4製備溶液A、B、C和D。供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時間等，參照所用儀器和試劑的有關說明進行。每種溶液至少做2個平行管。
表4 光度技術幹擾試驗溶液的製備
溶液
內毒素濃度
加入內毒素的溶液
平行管數
A
無
供試品溶液
不少於2個
B
標準曲線的中點（或附近點）的濃度（設為λm）
供試品溶液
不少於2個
C
至少3個濃度（最低一點設定為λ）
檢查用水
每一濃度不少於2個
D
無
檢查用水
不少於2個
溶液A：稀釋倍數未超過MVD的供試品溶液，
溶液B：加入了標準曲線中點或靠近中點的一個內毒素濃度的，和溶液A有相同稀釋倍數的供試品溶液，
溶液C：如“校驗標準曲線的標準性”項下描述的，用於製備標準曲線的標準內毒素溶液
溶液D：檢查用水（陰性對照）
按所得線性回歸方程分別計算出供試品溶液和含標準內毒素的供試品溶液的內毒素含量Ct和Cs，再按下式計算該試驗條件下的回收率（R）。
從包含添加內毒素的供試品溶液中減去溶液本身的平均的內毒素濃度，可計算出添加內毒素的平均回收率。當內毒素的回收率在50~200%之間，則認為在此試驗條件下供試品溶液不存在幹擾作用。
當內毒素的回收率不在指定的範圍內，須按“凝膠法幹擾試驗”中的方法去除幹擾因素。並要利用凝膠法幹擾試驗來驗證處理的有效性。
光度法檢查法
按照 “光度法的幹擾試驗”中的操作步驟進行檢測。
使用溶液C生成的標準曲線來計算溶液A的每一個平行管的內毒素濃度。
試驗必須符合以下三個條件方為有效：
1） 係列溶液C的結果要符合“光度技術預試驗”下的“校驗標準曲線的標準性”中的要求；
2） 用溶液B中的內毒素濃度減去溶液A中的內毒素濃度後，計算出的內毒素的回收率要在50~200%的範圍內。
3） 溶液D（陰性對照）在規定的反應時間內沒有可檢測到的內毒素。
當供試品溶液所有平行管的平均內毒素濃度乘以稀釋倍數和濃度後，小於產品的內毒素限值時，供試品符合規定。
細菌內毒素檢查法修改說明
在2000年以前，美國、歐洲、日本三個國家的藥典收載的細菌內毒素檢查法方法各異，所以缺乏可比性，因此2000年由國際協調委員會綜合USP、EP、JP的方法求同存異，出台了內毒素檢查法的協調案。現在，USP25、EP2000、JP14除保留少許特色外，無論是在方法上還是格式上都已趨向統一。
2000版中國藥典細菌內毒素檢查法主要是根據24版美國藥典製定的，與統一後的細菌內毒素檢查法有不小的差異。為使我國的細菌內毒素檢查法與世界接軌，本次檢查法的修改基本按照USP25、EP2000、JP14的統一格式，對於敘述順序、風格等進行了較大的調整，但同時也保留了2000年版檢查法的特色。
主要是將原來附錄指導原則中的細菌內毒素檢查法定量方法（光度法）與內毒素檢查法合並到一起。由於“凝膠法”和“光度法”的說法是以檢測原理命名的， “定量法”是相對於“定性”而叫的，所以認為將“定量法”改為“光度測定法”更為妥當。
凝膠法實驗的檢查法原來是做2支供試品管、1支供試品陽性對照、1支陽性對照和1支陰性對照（共5支）。由於各種對照是作為實驗是否成立的標準，同時參照各國藥典的統一格式，故改為做2支供試品管、2支供試品陽性對照、2支陽性對照和2支陰性對照（共8支）。
添加了凝膠法的半定量法。雖然此種方法在我國使用不多，但是許多進口藥品的複核標準中都要求使用半定量法，並且各國藥典都有收載，所以也作為一種方法提出。
本次修改的格式采用了國際統一的表格方式來表示樣品及各種對照的配製。
中檢所
崩解時限檢查法
本法用於檢查微生態活菌膠囊劑、片劑在規定條件下的崩解情況；即在檢查時限內全部崩解溶散或成碎粒，除不溶性包衣材料或破碎的膠囊殼外，均應通過篩網。
儀器
采用升降式崩解儀。主要結構為一能升降的金屬支架與下端鑲有篩網的吊籃，並附有擋板。升降的金屬支架上下移動距離為55mm±2mm，往返頻率為每分鍾30～32次。
吊籃玻璃管6根，管長77.5mm±2.5mm，內徑21.5mm，壁厚2mm；透明塑料板2塊，直徑90mm，厚6mm，板麵有6個孔，孔徑26mm；不鏽鋼板1塊(放在上麵一塊塑料板上)，直徑90mm，厚1mm，板麵有6個孔，孔徑22mm；不鏽鋼絲篩網1張(放在下麵一塊塑料板下)，直徑90mm，篩孔內徑20mm；以及不鏽鋼軸1根(固定在上麵一塊塑料板與不鏽鋼板上)，長80mm。將上述玻璃管6根垂直於2塊塑料板的孔中，並用3隻螺絲將不鏽鋼板、塑料板和不鏽鋼絲篩網固定，即得(如圖1)。
圖 1
（見2000版《中國藥典》二部 附錄73頁 圖-1）
擋板為一平整光滑的透明塑料塊，相對密度1.18～1.20，直徑20.7mm±0.15mm，厚9.5mm±0.15mm；擋板共有5個孔，孔徑2mm，中央1個孔，其餘4個孔距中心6mm，各孔間距相等；擋板側邊有4個等距離的V形槽，V形槽上端寬9.5mm，深2.55mm，底部開口處的寬與深度均為1.6mm(如圖2)。
圖 2
（見2000版《中國藥典》二部 附錄73頁 圖-2）
檢查法
將吊籃通過上端的不鏽鋼軸懸掛於金屬支架上，浸入1000ml燒杯中，並調節吊籃位置使其下降時篩網距燒杯底部25mm，燒杯內盛有溫度為37℃±1℃的水，調節水位高度使吊籃上升時篩網在水麵下15mm處。
1.片劑
取藥片6片，分別置上述吊籃的玻璃管中，啟動崩解儀進行檢查，各片均應在15分鍾內全部崩解。如有1片崩解不完全，應另取6片，按上述方法複試，均應符合規定。
薄膜衣片，按上述裝置與方法檢查，並可改在鹽酸溶液(9→1000)中進行檢查，應在30分鍾內全部崩解。如有1片不能完全崩解，應另取6片，按上述方法複試，均應符合規定。
腸溶衣片，按上述裝置與方法，先在鹽酸溶液(9→1000)中檢查2小時，每片均不得有裂縫、崩解或軟化現象；繼將吊籃取出，用少量水洗滌後，每管各加入擋板1塊，再按上述方法在磷酸鹽緩衝液(pH6.8)中進行檢查，1小時內應全部崩解。如有1片不能完全崩解，應另取6片，按上述方法複試，均應符合規定。
2.膠囊劑
硬膠囊劑按上述裝置與方法檢查，如膠囊漂浮於液麵，可加擋板一塊。硬膠囊劑應在30分鍾內全部崩解， 如有1粒不能完全崩解，應另取6粒，按上述方法複試，均應符合規定。
腸溶膠囊劑按上述裝置與方法，先在鹽酸溶液(9→1000)中檢查2小時，每粒的囊殼均不得有裂縫或崩解現象；繼將吊籃取出，用少量水洗滌後，每管各加入擋板一塊，再按上述方法，改在人工腸液中進行檢查，1小時內應全部崩解。如有1粒不能完全崩解，應另取6粒，按上述方法複試，均應符合規定。
【附注】
人工腸液:取磷酸二氫鉀6.8g，加水500ml使溶解，用0.4%氫氧化鈉溶液調節pH值至6.8；另取胰酶10g，加水適量使溶解；將兩液混合後，加水稀釋成1000ml，即得。
融變時限檢查法
本法係用於檢查栓劑、陰道片等固體製劑在規定條件下的融化、軟化或溶散情況。
1.栓劑
儀器
由透明的套筒與金屬架組成（如圖１）。
圖1 圖2
（見2000版《中國藥典》二部附錄74頁圖-1、圖-2）
透明套筒為玻璃或適宜的塑料材料製成，高為60mm，內徑為52mm，及適當的壁厚。
金屬架由兩片不鏽鋼的金屬圓板及3個金屬掛鉤焊接而成。每個圓板直徑為50mm,具39個孔徑為4mm的圓孔（如圖２）；兩板相距30mm，通過3個等距的掛鉤焊接在一起。
檢查法
取供試品3粒，在室溫放置1小時後，分別放在3個金屬架的下層圓板上，裝入各自的套筒內，並用掛鉤固定。除另有規定外，將上述裝置分別垂直浸入盛有不少於4L的37.0℃±0.5℃水的容器中，其上端位置應在水麵下90mm處。容器中裝一轉動器,每隔10分鍾在溶液中翻轉該裝置一次。
結果判斷
除另有規定外,脂肪性基質的栓劑3粒均應在30分鍾內全部融化、軟化或觸壓時無硬心；水溶性基質的栓劑3粒均應在60分鍾內全部溶解。如有1粒不合格,應另取3粒複試，均應符合規定。
2.陰道片
儀器
同上述栓劑的檢查裝置，但應將金屬架掛鉤的鉤端向下，倒置於容器內，如圖3示意。
圖3
（見2000版《中國藥典》二部附錄74頁圖-3）
檢查法
調節水液麵至上層金屬圓盤的孔恰為均勻的一層水覆蓋。取供試品3片，分別置於上麵的金屬圓盤上，裝置上蓋一玻璃板，以保證空氣潮濕。
結果判斷
除另有規定外，陰道片3片,均應在30分鍾內全部融化或崩解成碎粒並通過開孔金屬圓盤或僅殘留少量無固體硬心的軟性團塊。如有1片不合格,應另取3片複試,均應符合規定。
最低裝量檢查法
本法適用於固體、半固體和液體製劑。標示裝量不大於500g(ml)者，按下述方法檢查，應符合表中規定。為保證臨床有效使用，應按“生物製品分裝規程”適當增加裝量，使製劑裝量不少於標示量。
1．抽樣量
1．1 注射液：注射液的標示裝量為2ml或2ml以下者，取供試品5支，2ml以上至或10 ml者，取供試品3支，10ml以上者，取供試品2支。
1．2 固體、半固體和液體製劑：取供試品5個，標示裝量在50 ml（g）以上者，取供試品3個。
2．檢查法（適用於標示裝量以重量計者）
取供試品，除去外蓋和標簽，容器外壁用適宜的方法清潔並幹燥，分別精密稱定重量，除去內容物，容器用適宜的溶劑洗淨並幹燥，再分別精密稱定空容器的重量，求出每個容器內容物的裝量；如為固體、半固體和液體製劑還應求出每個容器內容物的平均裝量。
3．容量法（適用於標示裝量以容量計者）
取供試品，開啟時注意避免損失，將內容物分別用幹燥並預經標化的注射器(包括注射針頭)抽盡，50ml以上者可傾入預經標化的幹燥量筒中，黏稠液體傾出後，將容器倒置15分鍾，盡量傾淨。讀出每個容器內容物的裝量；如為固體、半固體和液體製劑還應求出每個容器內容物的平均裝量。
4．結果判定
每支注射液的裝量均不得少於其標示量。
固體、半固體和液體製劑應符合下表規定。 如有1個容器裝量不符合規定，另取5個（或3個）複試，應全部符合規定。
標示裝量
固體、半固體和液體
黏稠液體(容量法)
平均裝量
每個容器裝量
平均裝量
每個容器裝量
20g(ml)以下
不少於標示裝量
不少於標示裝量的93%
不少於標示裝量的90%
不少於標示裝量的85%
20g(ml)至50g(ml)
不少於標示裝量
不少於標示裝量的95%
不少於標示裝量的95%
不少於標示裝量的90%
50g(ml)至500g(ml)
不少於標示裝量
不少於標示裝量的97%
不少於標示裝量的95%
不少於標示裝量的93%
裝量（片重）差異檢查法
本法用於膠囊劑、片劑、顆粒劑 和散劑的裝量檢查。
檢查法
1.膠囊劑 ：取供試品20粒,分別精密稱定重量,並傾出內容物，硬膠囊
用小刷或其他適宜用具拭淨,軟膠囊用乙醚等易揮發性溶劑洗淨,置通風處使溶劑自然揮盡；再分別精密稱定囊殼重量,求出每粒內容物的裝量與平均裝量。
2.片劑：取藥片20片, 精密稱定總重量；再分別精密稱定每片的重量。
3.顆粒劑（單劑量）：取供試品10包(瓶),除去包裝,分別精密稱定每包 (瓶) 內容物的重量, 求出每包(瓶)內容物的裝量與平均裝量。
4.散劑（單劑量）:取散劑10包(瓶)，除去包裝，分別精密稱定每包(瓶) 內容物的重量。
結果判定
1膠囊劑：每粒的裝量與平均裝量相比較,超出裝量差異限度的膠囊不得多於2粒,並不得有1粒超出限度1倍。
平均裝量
裝量差異限度
0.30g以下
0.30g或0.30g以上
+10%
+7.5%
2片劑：每片重量與平均片重相比較,超出重量差異限度的藥片不得多於2 片,並不得有1片超出限度1倍。
平均重量 重量差異限度
平均重量
重量差異限度
0. 30g以下
0.30g或0.30g以上
+7.5%
+5%
3顆粒劑（單劑量）：每包(瓶)裝量應與平均裝量相比較 ,超出裝量差異限度的顆粒劑不得多於2包(瓶),並不得有1包(瓶)超出裝量差異限度1倍。
平均裝量
裝量差異限度
1.0g或1.0g以下
1.0g以上至1.50g
1.50g以上至6.0g
6.0g以上
+10%
+8%
+7%
+5%
4散劑（單劑量）:每包與標示量相比應符合規定，超出裝量差異限度的散劑不得多於2包(瓶)，並不得有1包(瓶)超出裝量差異限度1倍。
標示裝量
裝量差異限度
0.10g或0.10g以下
±15%
0.10g以上至0.30g
±10%
0.30g以上至1.50g
±7.5%
1.50g以上至6.0g
±5%
6.0g以上
±3%
[注意事項]
多劑量包裝的顆粒劑和散劑,均照最低裝量檢查法(附錄X F)檢查,應符合規定。
粒度測定法
本法用於測定微生態活菌顆粒劑、散劑的粒子大小和限度。
測定法：雙篩分法
采用大號篩為18號（850μm）和小號篩為200號(75μm)的一迭篩，大號篩上加蓋，小號篩下配有密合的接受容器。
稱取10.0g製品，置大號篩內，蓋上蓋後，保持水平狀態過篩，左右往返，邊篩動邊拍打3分鍾。 取不能通過大號篩和能通過小號篩的顆粒及粉末，稱定重量，計算其所占比例(%)。
結果判定
應全量通過大號篩，且通過小號篩的應低於全量15%，則判為合格。
F（ab）2含量測定法（SDS—PAGE法）
在電泳過程中，應用一種人工合成的凝膠作為支持物，在電場作用下，使具有不同泳動速度的組分形成各自區帶，再通過薄層掃描進行定量檢測分析。
儀器
穩壓穩流電泳儀
薄層掃描儀
天平
試劑
1. 丙烯酰胺溶液 取丙烯酰胺14g，雙丙烯酰胺0.367g，加水使溶解成50ml。
2. 緩衝液 取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)17.8g、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)103g、SDS 4g，加水使溶解成2000ml。
3. 10% SDS 溶液 取SDS 10g，加水使溶解成100ml。
4. 樣品結合液 取10% SDS 溶液4ml，緩衝液0.2ml，甘油10ml，加水配製成20ml。
5. 電極緩衝液 取上述緩衝液稀釋1倍。
6. 固定液 取甲醇400ml，冰醋酸70ml，加水配製成1000ml。
7. 染色液 取考馬斯亮藍2.5g，加500ml甲醇，冰醋酸70ml，再加水使溶解成1000ml。
8. 脫色液 取冰醋酸70ml，甲醇50ml，加水配製成1000ml。
9. 幹燥液 取甘油30ml，甲醇200ml，加水配製成1000ml。
供試品溶液的製備
用電極緩衝液將供試品稀釋至2mg/ml後，取稀釋的供試品0.1ml，加供試品結合液0.1ml ,100℃煮沸1至2分鍾或37℃2小時,冷卻。
測定法
按下列比例製備需要量凝膠溶液: 0.2mol/L PB: 丙烯酰胺溶液：水：1.5%過硫酸銨體積比為2:1:0.8:0.25。最後加1至2滴四甲基乙二胺(TEMED),混勻後立即將膠液加入電泳槽的玻璃板間,要避免產生氣泡。於每一供試品孔內加入已經處理過的供試品25ug蛋白，電泳。電泳條件為每一個供試品孔的電流恒定為2至3mA。當溴酚藍電泳至底部時停止電泳。
電泳完畢後，將電泳後的膠板放入固定液中過夜。於染色液中染色1至2小時,然後置脫色液中進行脫色,直至底色成為無色為止。用適宜的方法幹燥保存膠板。
結果計算
將幹燥前或後的膠板用掃描儀於575nm或520 nm處對每一供試品進行掃描,得出(或計算出) 供試品中F(ab)2的百分含量。
類毒素絮狀單位（Lf）測定法
根據類毒素與相應抗毒素在適當的含量比例及一定溫度條件下經一定反應時間，可在試管中發生抗原抗體結合，產生肉眼可見的絮狀凝集反應。利用已知效價單位的絮狀反應抗毒素國家標準品（簡稱：標絮抗）測定待檢類毒素的絮狀單位（Lf）值。本方法適用於白喉、破傷風類毒素的測定。
儀器 恒溫水浴箱；溫度計
試劑
硼酸鹽緩衝液（pH 7.0~7.2）：硼酸鈉（Na2B4O7.10H2O）0.5g, 硼酸 (H3BO3) 4.5g, 氯化鈉(NaCl) 8.5g, 加蒸餾水1000ml，完全溶解。
標準品溶液的配製
用標準吸管準確量取標準白喉或破傷風絮狀反應抗毒素國家標準品，用硼酸鹽緩衝液在50ml或100ml容量瓶中準確定容至100Lf/ml。
供試品溶液的配製
用標準吸管準確量取待檢類毒素，加硼酸鹽緩衝液稀釋。
測定法
用1ml標準吸管準確量取100Lf/ml的標準絮狀抗毒素0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml分別加入絮狀反應管，用5ml或10ml標準吸管量取供試品分別快速準確加入上述反應管內各1ml，搖勻，放45℃恒溫水浴箱，經常觀察，記錄絮狀出現次序和時間（kf）。再取5支反應管，以最先出現絮狀之管放中間，前後各加兩管不同量標絮抗，每管間隔0.05ml，再向各管中加入供試品1ml，觀察絮狀出現情況。根據結果再將最先出現管放中間，加入標絮抗，每管間隔0.02ml，同上觀察並記錄結果，以2~3次相同值為最終測定值。
結果計算
待檢類毒素絮狀單位（Lf/ml）=稀釋標絮抗使用ml數×供試品稀釋倍數X100。
A群腦膜炎球菌多糖疫苗多糖分子大小測定法
本法用於測定細菌莢膜多糖在色譜柱中的分配係數（KD）和多糖在規定KD值以前的回收率。
第一法
儀器
瓊脂糖4B凝膠或瓊脂糖CL—4B凝膠色譜柱， 組分收集器，紫外分光光度計，色譜泵
試劑
1. 流動相 稱取醋酸銨154g，加水使溶解成1000ml，混勻，用氨水調pH值至7.0，加0.01%疊氮鈉防腐 。
2. 藍色葡聚糖2000溶液 稱取20mg藍色葡聚糖2000，加流動相使溶解成10ml。
3. 鉻酸鉀或維生素B12溶液 稱取10mg鉻酸鉀或維生素B12，加流動相使溶解成10ml。
色譜柱的製備
取瓊脂糖4B凝膠或瓊脂糖CL—4B凝膠約200ml，加流動相400ml充分攪拌，放置約1小時使其沉澱，傾去上層含懸浮顆粒的懸液。如此反複3～5次後，加200ml流動相，混勻，置真空抽氣裝置內抽去凝膠中的空氣。於1.5cm ×90cm色譜柱中，將漂洗過的瓊脂糖4B凝膠或瓊脂糖CL—4B凝膠裝至約87cm高，用流動相流洗，流速15～20ml/h，以2～3倍柱床體積的流動相流洗，使柱床平衡。
色譜柱的標定
取藍色葡聚糖2000溶液各1ml,加於已平衡的色譜柱中，以流動相流洗，用組分收集器收集洗脫液，每管收集3ml，按照分光光度法（附錄IV）項下的比色法於260nm波長測定各管洗脫液的吸光度，以吸光度為縱坐標，洗脫體積（ml）為橫坐標分別作圖，260nm波長下的峰頂洗脫體積為空流體積Vo。
取鉻酸鉀或維生素B12溶液1ml,加於已平衡的色譜柱中，以流動相流洗，用組分收集器收集洗脫液，每管收集3ml，按照分光光度法（附錄IV）項下的比色法於370nm波長測定各管洗脫液的吸光度，以吸光度為縱坐標，洗脫體積（ml）為橫坐標分別作圖，370nm波長下的峰頂洗脫體積為柱床體積Vi。
測定法
取供試品約1ml（含多糖抗原3～5mg，如為凍幹製品可用流動相溶解），加於已標定的色譜柱中，用流動相流洗，用組分收集器收集洗脫液，每管收集5ml，按照磷含量測定法（以流動相作空白對照）於820nm測定每管洗脫液的吸光度。以供試品每管洗脫液的吸光度為縱坐標，洗脫液體積（ml）為橫坐標作圖，主峰峰頂洗脫體積為Ve。
結果計算
按下述公式計算分配係數。
KD = (Ve – Vo)/(Vi – Vo)
KD為供試品分配係數；
Ve為供試品洗脫液體積，ml；
Vo為空流體積，ml；
Vi為柱床體積，ml。
計算供試品在規定KD值以前的多糖回收率
Rx(%) = Ax/At × 100％
Rx為KD值在製品分子大小檢查項下規定的值以前供試品的多糖回收率；
Ax為供試品在規定的KD值以前各管洗脫液的吸光度之和；
At為供試品所有管洗脫液的吸光度之和。
第二法
儀器
瓊脂糖4B凝膠或瓊脂糖CL—4B凝膠色譜柱，紫外監測器，紫外分光光度計、色譜泵 ，組分收集器
試劑
1. 流動相 稱取氯化鈉11.7g，加水使溶解使成1000ml，混勻，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調pH至7.0，加0.01%疊氮鈉防腐。
2. 藍色葡聚糖2000溶液 稱取20mg藍色葡聚糖2000，加流動相使溶解成10ml。
3. 鉻酸鉀或維生素B12溶液 稱取10mg，加流動相使溶解成10ml。
色譜柱的製備
取瓊脂糖4B凝膠或瓊脂糖CL—4B凝膠約200ml，加流動相400ml充分攪拌，放置約1小時使其沉澱，傾去上層含懸浮顆粒的懸液。如此反複3～5次後，加200ml流動相，混勻，置真空抽氣裝置內抽去凝膠中的空氣。於1.5cm × 90cm色譜柱中，將漂洗過的瓊脂糖4B凝膠或瓊脂糖CL—4B凝膠裝至約87cm高，用流動相流洗，流速15～20ml/h，以2～3倍柱床體積的流動相流洗，使柱床平衡。
色譜柱的標定
取藍色葡聚糖2000溶液1ml和鉻酸鉀或維生素B12溶液0.2ml，混勻後加於已平衡的色譜柱中，以流動相流洗，流速15～20ml/h，用組分收集器收集洗脫液，並監測各管在206nm 處的吸光度，得到的色譜圖中有兩個峰，第一峰為藍色葡聚糖2000洗脫峰，峰頂的洗脫體積為空流體積Vo；第二峰為鉻酸鉀或維生素B12的洗脫峰，峰頂的洗脫體積為柱床體積Vi。
測定法
取供試品約1ml（含多糖抗原3～5mg，如為凍幹製品可用流動相溶解），加於已標定的色譜柱中，用流動相流洗，流速15～20 ml/h，用組分收集器收集洗脫液。於206nm處檢測，得到供試品的色譜圖。
結果計算
1. 計算供試品分配係數（KD）：
KD = (Ve – Vo)/(Vi – Vo)
KD為供試品分配係數；
Ve為供試品洗脫液體積，ml；
Vo為空流體積，ml；
Vi為柱床體積，ml。
2. 計算供試品在規定KD值以前多糖回收率
Rx(%) = Ax/At ×100％
Rx為KD值在製品分子量大小檢查項下規定的值以前供試品的多糖回收率；
Ax為供試品在規定KD值以前的圖譜麵積；
At為供試品圖譜總麵積。
［附注］
1. 過柱操作在10～15 0C下進行。
2. 樣品的加入 進樣可采用自動進樣閥，也可以直接將樣品加在床的表麵。
起草說明： 第一法為現行版《中國生物製品規程》方法，第二法為新建方法，擬用第二法代替第一法測多糖分子量大小。
傷寒Vi多糖疫苗多糖分子大小測定法
本法用於測定細菌莢膜多糖在色譜柱中的分配係數（KD）和多糖在規定KD值以前的回收率。
儀器裝置
瓊脂糖CL—4B凝膠色譜柱，紫外監測器，組分收集器
試劑
1. 流動相 稱取氯化鈉11.7g，加水使溶解使成1000ml，混勻，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調pH至7.0，加0.01%疊氮鈉防腐。
2. 藍色葡聚糖2000溶液 稱取20mg藍色葡聚糖2000，加流動相使溶解成10ml。
3. 鉻酸鉀或維生素B12溶液 稱取10mg，加流動相使溶解成10ml。
色譜柱的製備
取瓊脂糖CL—4B凝膠約200ml，加流動相400ml充分攪拌，放置約1小時使其沉澱，傾去上層含懸浮顆粒的懸液。如此反複3～5次後，加200ml流動相，混勻，置真空抽氣裝置內抽去凝膠中的空氣。於1.5cm X 90cm色譜柱中，將漂洗過的瓊脂糖4B凝膠或瓊脂糖CL—4B凝膠裝至約87cm高，用流動相流洗，流速15～20ml/h，以2～3倍柱床體積的流動相流洗，使柱床平衡。
色譜柱的標定
取藍色葡聚糖2000溶液1ml和鉻酸鉀或維生素B12溶液0.2ml，混勻後加於已平衡的色譜柱中，以流動相流洗，流速15～20ml/h，用組分收集器收集洗脫液，以260nm監測各管的光吸收度，得到的色譜圖中有兩個峰，第一峰為藍色葡聚糖2000洗脫峰，峰頂的洗脫體積為空流體積Vo；第二峰為鉻酸鉀或維生素B12的洗脫峰，峰頂的洗脫體積為柱床體積Vi。
測定法
取供試品約1ml（含多糖抗原3～5mg），加於已標定的色譜柱中，用流動相流洗，流速15～20 ml/h，用組分收集器收集洗脫液，每管約2ml。照O—乙酰基含量測定法，測定每管洗脫液中O—乙酰基的含量，求出O—乙酰基含量最高時的洗脫體積，即為多糖主峰峰頂洗脫體積Ve。
結果計算
計算供試品分配係數：
KD = (Ve – Vo)/(Vi – Vo)
KD為供試品分配係數；
Ve為供試品洗脫液體積，ml；
Vo為空流體積，ml；
Vi為柱床體積，ml。
計算供試品在KD≤0.25時多糖回收率
Rx(%) = I液O—乙酰基的含量/（I液O-乙酰基的含量+ II液O-乙酰基的含量）×100％
Rx為KD值在製品分子量大小檢查項下規定的值以前供試品的多糖回收率；
I液： 為合並KD=0.25前的洗脫液；
II液：為合並KD=0.25後的洗脫液。
［附注］ 過柱操作在10～15 0C下進行。
乙醇殘留量測定法（康維氏皿擴散法）
乙醇在飽和碳酸鈉環境中加熱可逸出，在密閉環境中可被重鉻酸鉀硫酸溶液吸入，反應生成黃棕色物質，可用比色法進行殘餘乙醇含量限度測定。該法用於血液製品原液檢定
試劑
1. 飽和碳酸鈉溶液 取碳酸鈉(Na2CO3·10H2O)199.5g，加水200ml，搖勻，即得。用時充分搖勻後取上清液。
2. 重鉻酸鉀硫酸溶液 取重鉻酸鉀3.7g，加水150ml，充分溶解後緩慢加入硫酸280ml，放冷，加水至500ml，搖勻，即得。
乙醇對照品溶液的配製
精密量取無水乙醇30μl，置100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得0.03%（ml/ml）乙醇對照品溶液。
測定法
在康維氏皿外圈的凸出部位均勻塗上凡士林，精密量取重鉻酸鉀硫酸溶液2.0ml加入內圈中，取飽和碳酸鈉溶液1.5ml和精密量取供試品1.5ml，加入外圈中，立即加蓋玻璃板（粗糙麵向下）密封擴散皿，搖勻，80℃反應30分鍾後，取內圈溶液，照分光光度法（附錄取IA），在650nm波長處測定吸光度。精密量取乙醇對照品溶液1.5ml，同法操作；精密量取1.5ml水，同法操作，做為空白對照。按下式計算：
殘留乙醇含量（ml/ml）=（A1/A2）C2
A1 為供試品在650nm處吸光度；
A2 為乙醇對照品溶液在650nm處吸光度；
C2 為乙醇對照品溶液濃度，ml/ml。
蛋白質含量測定（雙縮脲法）
蛋白質肽鍵在堿性溶液中與Cu2＋形成紫紅色絡合物，其顏色深淺與蛋白質含量成正比，利用標準蛋白質溶液作對照，采用分光光度法測定供試品中蛋白質含量。該法用於血液製品原液檢定。
試劑
雙縮脲試劑 取硫酸銅（CuSO4·5H2O）3.0g，酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）9.0g，碘化鉀5.0g，氫氧化鈉24g，加水使溶解成1000ml，搖勻，即得。
蛋白質對照品溶液的配製
精密量取適量的蛋白質對照品溶液，加水製成50mg/ml的溶液。
供試品溶液的配製
精密量取適量的供試品，加水製成50mg/ml的溶液。
測定法
分別精密量取供試品溶液、蛋白質對照品溶液各0.05ml於玻璃試管中，加4.0ml雙縮脲試劑，混勻，37℃水浴30分鍾，照分光光度法（附錄IV A），在540nm的波長處測定吸收度。另精密量取0.05ml水，同法操作，作為空白對照。
結果計算
按下式計算供試品中蛋白質含量。
C= (A1/A2 )×C1×n
C為供試品蛋白質濃度，mg/ml;
A1 為供試品在540nm波長處的吸光度；
A2 為標準品在540nm波長處的吸光度；
C1 為標準蛋白質溶液的濃度，mg/ml。
[附注]
本法的測定範圍為1～10mg。
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