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諾如病毒檢測原理與富集



錄入時間:2014-3-7 11:12:36 來源:betway必威西汉姆联生物

諾如病毒(Norovirus,NV)是引起全世界所有年齡組人群急性胃腸炎暴發流行的重要病原之一。屬杯狀病毒科,諾如病毒屬單股正鏈RNA病毒,其基因組長度為7 kb~7.5 kb,病毒直徑約為26 nm~35 nm,無包膜,表麵粗糙,球形,呈二十麵體對稱;電鏡下缺乏顯著的形態學特征,負染色電鏡照片顯示,NV是具有典型的羽狀外緣,表麵有凹痕的小圓狀結構病毒。

方法原理

在甘氨酸緩衝液中通過物理研磨對分離出的樣品均質以釋放病毒,PEG8000沉降病毒。提取總RNA後,進行進一步純化。利用普通RT-PCR和實時熒光RT-PCR進行檢測,對可疑的PCR產物進行測序分析確定其基因型別。

病毒的富集

無菌取樣,在5 g檢樣中加入35 mL甘氨酸緩衝液(樣品重量與緩衝液體積之比為1:7);組織勻漿器中高速勻漿3 min,充分破碎混勻。

將所有均質液轉移到50 mL離心管中,37 ℃孵育30 min或室溫下振蕩30min;4 ℃,10000×g離心30 min。

取上清,加入10ml氯仿或更多,充分振搖,放置10min,中間振搖一次,4 ℃,10000×g離心30 min。

取上清至另一幹淨的100 mL離心管中,加入等體積的PEG 8000溶液(PEG終濃度為8%),上下顛倒離心管以充分混勻。

7.2.5 冰上放置至少1 h,4℃,10000×g離心5 min。棄去上清,保留沉澱。

 

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