1）原理：將含有定量抗菌藥物的紙片貼在測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中的水分溶解後不斷地向紙片周圍擴散，形成遞減的濃度梯度。 在紙片周圍可抑菌濃度範圍內測定菌的生長被抑製，從而形成無菌生長的透明圈即抑菌圈。 抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感性。
(2) 製備抗菌藥物紙片 專用藥敏紙片：用加樣或浸泡的方法使每片的藥量達到一定的規定量，冷凍幹燥後密封，-20°C保存備用。 （3）配製培養基
水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）瓊脂是對生長較快的需氧和兼性厭氧菌進行藥敏試驗的標準培養基，pH7.2-7.4，瓊脂厚度為4mm。
對營養要求較高的細菌進行藥敏試驗時，應在MH瓊脂中加入相應的營養添加劑。 （4）細菌接種
接種物的準備可采用生長法或直接菌落懸液法。
為使藥敏試驗的接種濃度標準化,應使用0.5麥氏比濁標準的菌液濃度，製備好的菌液應在15min內接種完畢。
置35℃孵育16-18h後讀取結果，厭氧菌應孵育在含CO2的環境中，葡萄球菌和腸球菌必須孵育24h，以檢測對苯唑西林和萬古黴素的耐藥性。 （5） 結果解釋和報告
用遊標卡尺或直尺量取抑菌圈直徑，參照NCCLS標準判斷結果。常分為以下三級：敏感、中度敏感、低度敏感 （6）紙片法藥敏結果的影響因素
培養基的質量對結果的準確性有直接影響，如pH、硬度、濕度和深度等； 藥敏紙片的含藥量是影響抑菌圈大小的重要因素； 接種菌量正確與否是影響結果的重要因素之一； 試驗操作質量；培養條件和溫度、時間； 抑菌圈測量工具的精確度；
質控菌株本身的藥敏特性是否合格，有無變異。 （7）質量控製
采用標準菌株是進行藥敏試驗質量控製的主要措施。
常用的臨床藥敏質控標準菌株有：金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸杆菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853 等。
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