血凝抑製試驗

1.適用範圍

本標準規定了禽流感的血凝試驗、血凝抑製試驗。

本標準適用於禽流感抗體的檢測（主要適用於血清樣品）。

 

2  血凝試驗

2.1  材料與試劑

2.1.1  器材：普通天平、分析天平、普通離心機、微型振蕩器、注射器、冰箱、高壓滅菌器、微量移液器及96孔V形血凝反應板。

2.2.2  pH7.2磷酸鹽緩衝液(PBS)，配製方法參見附錄A。

2.2.3  1%雞紅細胞懸液，配製方法參見附錄B。

2.2.4  阿氏液，配製方法參見附錄C。

2.2.5  標準禽流感病毒抗原，購入的標準禽流感病毒應檢測其血凝效價並進行無菌檢驗，以檢查與所標HA效價是否相符。若不符，應重複檢測並到相關實驗室驗證。

 

2.2  操作程序

A. 取96孔V形微量反應板，用微量移液器在1~12孔每孔加25 μL PBS，共滴8排，後四排的第1列孔再補加25 μL PBS。

B. 吸取25 μL標準禽流感抗原加入到第1列孔中，吹打3~5次充分混勻。

C. 從第1列孔吸取25 μL混勻後的抗原液加到第2列孔中，混勻後吸取25μL加入到第3列孔中，依次進行係列倍比稀釋至第11列孔，最後從第11列孔各吸取25 μL棄之，設第12列孔為紅細胞對照。

D. 自右向左依次向各孔加入25 μL 1%的雞紅細胞懸液。

E. 將反應板置於微量振蕩器上振蕩1 min，室溫（20-25℃）靜置45 min後觀察結果，若環境溫度過高，可於4℃靜置60 min，紅細胞對照孔成明顯的紐扣狀沉到孔底時即可判定結果。

 

2.3  結果判定

A. 在紅細胞對照孔出現正確結果的情況下，將反應板作45°傾斜，觀察紅細胞是否完全凝集。以完全凝集的病毒最大稀釋度為該抗原的血凝滴度。完全凝集的病毒的最高稀釋倍數為1個血凝單位（HAU）。

B. 最終結果取2倍、3倍倍比稀釋抗原的血凝滴度的幾何平均值。

 

3  血凝抑製試驗

3.1  材料與試劑

3.1.1  器材：普通天平、分析天平、普通離心機、微型振蕩器、煮沸消毒器、冰箱、高壓滅菌器、微量移液器及96孔V形血凝反應板。

3.1.2  pH7.2磷酸鹽緩衝液(PBS)配製方法參見附錄A。

3.1.3  1%雞紅細胞懸液配製方法參見附錄B。

3.1.4  阿氏液，配製方法參見附錄C。

3.1.5  4單位抗原，製備方法參見附錄D。

3.1.6  HA效價高於10log2時可繼續增加稀釋的孔數。

 

3.2  操作程序

A. 根據血凝試驗結果配製4單位抗原。以能引起100%血凝的病毒最高稀釋倍數代表1個血凝單位，4單位抗原的的配製方法如下：假設抗原的血凝滴度為1:256（28），則4單位抗原的稀釋倍數應是1:64（256除以4），稀釋時，將1 mL抗原加入到63 mL PBS中即為4單位抗原。但是該4單位抗原必須經過驗證（如附錄D  4單位抗原的標定）後才可確定其稀釋倍數，用於血凝抑製效價的測定。

B. 取96孔V形微量反應板，用移液器在第1~11孔各加入25 μL PBS，第12孔加入50 μL PBS。

C. 在第1孔加入25 μL被檢血清，充分混勻後移出25 μL加至第2孔，依次類推，倍比稀釋至第10孔，第10孔棄去25 μL，設第11孔為病毒對照，第12孔為紅細胞對照。

D. 在第1~11孔各加入25 μL 4單位抗原，輕叩反應板，使反應物混合均勻，室溫20-25℃下靜置30 min。

E. 自右向左依次向各孔加入25 μL 1%的雞紅細胞懸液。

F. 將反應板置於微量振蕩器上振蕩1 min，室溫（20-25℃）靜置40 min後觀察結果，若環境溫度過高，可於4℃靜置60 min，紅細胞對照孔成明顯的紐扣狀沉到孔底時即可判定結果。

 

3.3  結果判定

A. 在紅細胞對照出現完全沉澱、病毒對照出現完全凝集的情況下，將反應板作45°傾斜，從反應板背側觀察。以完全抑製紅細胞凝集的最大稀釋倍數判為該血清的血凝抑製滴度。

B. 當被檢血清對其HI效價大於等於4log2，判為禽流感抗體陽性。

 

附錄A

pH7.2磷酸鹽緩衝液(PBS)配製

氯化鈉（NaCl）

氯化鉀（KCl）

磷酸氫二鈉（Na2HPO4）

磷酸二氫鉀（KH2PO4）

加蒸餾水至

將上述成分依次溶解，用鹽酸（HCl）調pH至7.2，分裝，121℃、15 min高壓滅菌，一經使用，於4℃保存不超過3周。

 

附錄B

1%雞紅細胞懸液配製

采集至少3隻2~6月齡SPF公雞或無禽流感和禽流感抗體的非免疫雞的抗凝血液與等量檸檬酸鈉溶液混合，放入離心管中，加入3~4倍體積的PBS混勻，以1500 r/min離心5~10 min，去掉血漿和白細胞層，反複洗滌三次，最後吸取壓積紅細胞用PBS配製成體積分數為1%的懸液，於4℃保存備用。

 

附錄C

阿氏液的配製

葡萄糖（C6H12O6．H2O)

檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7.2H2O)

檸檬酸（C6H8O7.H2O）

氯化鈉（NaCl)

加蒸餾水至100 ml，溶解，過濾，分裝，121℃、30 min高壓滅菌，4℃保存備用。

 

附錄D

4單位抗原的製備

根據血凝試驗測定的血凝效價，判定4個血凝單位的稀釋倍數，並作複歸試驗。例如：病毒2倍倍比稀釋時的HA效價為9log2，3倍時的HA效價為8log2，其4個血凝單位為6log2~7log2，則將病毒在96~128倍稀釋。則可以假定90×，100×，110×，120×，130×為4HAU，分別再作2×、3×、4×、5×、6×稀釋，每個4個孔，並作紅細胞和病毒對照，依此做一次血凝實驗，從而確定4單位抗原。判定時4×的半數100%凝集則為4單位抗原，1個100%凝集說明稀釋倍數偏大，3個100%凝集稀釋倍數偏小。