無血清培養基的基本配方:基本成分為基礎培養基及添加組分兩大部分。 用於生物製藥和疫苗生產的細胞在體外培養時,多數呈貼壁生長或兼性貼壁生長;而當其在無血清、無蛋白培養基中生長時,由於缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白,細胞往往以懸浮形式生長。
添加組分
1. 促貼壁物質:許多細胞必須貼壁才能生長,這種情況下無血清培養基中一定要添加促貼壁和擴展因子,一般為細胞外基質,如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子,對許多細胞的繁殖和分化,起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化,這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質細胞、CHO細胞、成肌細胞等。
2. 促生長因子及激素:針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質,有些激素是許多細胞必不可少的,如胰島素。
3. 酶抑製劑:培養貼壁生長的細胞,需要用胰酶消化傳代,在無血清培養基中必不可少須含酶抑製劑,以終止酶的消化作用,達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶;抑製劑。
4. 結合蛋白和轉運蛋白:常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大,可增加培養基的粘度,保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養的無血清培養基都含有牛血清白蛋白。
5. 微量元素:硒是最常見的。
使用方法
目前,血清仍是動物細胞培養中最基本的的添加物,尤其是在原代培養或者細胞生長狀況不良時,常常會先使用有血清的培養液進行培養,待細胞生長旺盛以後,再換成無血清培養液。細胞轉入無血清培養基培養要有一個適應過程,一般要逐步降低血清濃度,從10%減少到5%,3%,1%,直至無血清培養。在降低過程中要注意觀察細胞形態是否發生變化,是否有部分細胞死亡,存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特性等。在實驗後這些細胞一般不再繼續保留,很少有細胞能夠長期培養於無血清培養基而不發生改變的。細胞轉入無血清培養之前,要留有種子細胞,種子細胞按常規培養於含血清的培養基中,以保證細胞的特性不發生變化。
為了使細胞適應無血清培養,關鍵的是使所培養細胞:
1. 處於對數生長中期
2. >90% 活細胞率
3. 適應時以較高的起始細胞接種
細胞適應無血清培養基的方法
1. 直接適應--細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基(SFM)中。
2. 連續適應--分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基(SFM)中,與直接適應相比較,連續適應趨向對於細胞更加溫和一些。
特別需要強調的是:配製無血清培養液必須使用高質量的水,如石英玻璃蒸餾器經三次蒸餾或超純水淨化裝置製備的水。因為無血清培養基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子,既便水中的有毒物質含量甚微,也可能對細胞產生致死性損害。這是無血清培養能否成功的關鍵因素之一。
無血清培養基的優點
1. 可避免血清批次間的質量變動,提高細胞培養和實驗結果的重複性。
2. 避免血清對細胞的毒性作用和血清源性汙染。
3. 避免血清組分對實驗研究的影響。
4. 有利於體外培養細胞的分化。
5. 可提高產品的表達水平並使細胞產品易於純化。
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