進出口食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢測方法
1、 範圍
本標準規定了進出口食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測方法。
本標準適用於進出口食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測。
2、 規範性引用文件
下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款，凡是注日期的引用文件，其隨後所有的修改單（不包括錯誤的內容）或修訂修訂版均不使用於本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本，凡是不注日期的引用文件，其最新版本，凡是不住日期的引用文件，其最新版本適用於本標準。
GB/T4789.28—2003 食品微生物學檢驗 染色法、培養基和試劑
SN 0330—1994 出口食品中微生物學檢驗通則
3、 設備和材料
3.1 冰箱：4℃~~20℃
3.2 恒溫培養箱：30℃±1℃、24℃±1℃、35℃±1℃
3.3 恒溫水浴鍋
3.4 均質器。
3.5 顯微鏡：10X~100X
3.6 離心機：4000r/min。精度0.1g。
3.8 VIDAS全自動免疫酶標分析儀。
注：VIDAS全自動免疫酶標分析儀是由法國梅裏埃公司提供的產品的商品名，給出這一消息是為了方便本標準的使用者，並不表示對該產品的認可，如果其他等效產品具有相同的效果，則可以使用這些等效產品。
3.9 高壓滅菌鍋。
3.10 解剖鏡。
3.11 錐形瓶：100ml、500ml.
3.12 滅菌吸管：1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)。
3.13 滅菌平皿：直徑90mm。
3.14 滅菌試管：16mm×160mm
3.15 離心管：30mm×100mm
3.16 單核細胞增生李斯特氏菌標準株。
3.17 綿羊李斯特氏菌標準株。
3.18 英諾克李斯特氏菌標準株。
3.19 西爾李斯特氏菌標準株。
4、培養基和試劑
除另有規定外，所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。
4.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉湯（TSB-YE）：見第A.1章。
SN/T 0184.1—2005
4.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆瓊脂（TSA-YE）：見第A.2章。
4.3 Fraser肉湯增菌液（FB1，FB2）見第A.3章。
4.4 PALCAM瓊脂：見第A.4章。
4.5 OXA瓊脂：見第A.5章。
4.6 7%羊血瓊脂：見第A.6章。
4.7 SIM動力培養基：見第A.7章。
4.8 三糖鐵（TSI）瓊脂：按GB/T 4789.28—2003中3.4
4.10 緩衝葡萄糖蛋白腖水（MR和VP試驗用）：按GB/T 4789.28—2003中3.4
4.11 糖發酵培養基：見第A.8章。
4.12 過氧化氫酶試驗：按GB/T 4789.28—2003中3.20
4.13 鹽酸 黃溶液：見第A.3.2.1章。
4.14 奈啶酮酸鈉鹽溶液：見第A.3.2.2章。
4.15 檸檬酸鐵銨溶液:見第A.3.2.3章.
4.16 VIDAS單核細胞增生李斯特氏菌測試條。
注：VIDAS單核細胞增生李斯特氏菌測試條是由法國梅裏埃公司提供的產品的商品名，給出這一消息是為了方便本標準的使用者，並不表示對該產品的認可，如果其他等效產品具有相同的效果，則可以使用這些等效產品。
4.17 API裏斯特氏菌鑒定條
注：API裏斯特氏菌鑒定條是由法國梅裏埃公司提供的產品的商品名，給出這一消息是為了方便本標準的使用者，並不表示對該產品的認可，如果其他等效產品具有相同的效果，則可以使用這些等效產品。
5、 檢驗程序
6、檢驗步驟
6.1 樣品的存放與製備如為冷凍樣品應於2℃~5℃解凍，且不超於18h，若不能及時檢驗，應置於-15℃保存，非冷凍的易腐樣品應盡可能及時檢驗，若不能及時檢驗，應置於4℃冰箱保存，在24h之內檢驗。
無菌取樣品25g（ml）放入滅菌均質杯或均質袋中加225mLPBZE增菌液中，充分均質。
6.2 增菌培養
FB1增菌液225ML放30℃±1℃培養25h±1h吸收1ml加入10mlFB2增菌液中放30℃±1℃二次增菌25h±1h.
6.3 VIDA8快速篩選
取FB2增菌液，可按儀器生產廠的說明采取VIDA8快速篩選法進行快速篩選檢測，75min可獲初步結果。對於篩選為陰性的結果可直接按8.2報告來檢出單核細胞李斯特氏菌。對於篩選為陽性的結果按照6.4和6.9的條款進行分離培養和鑒定。
6.4 分離培養
6.4.1 選擇性培養基的分離培養
取增菌液一杯，劃線分離於選擇性培養基OXA、PALCAM瓊脂平板上30℃±1℃培養24h~48h
6.4.2黑色菌落觀察
李斯特氏菌在OXA瓊脂平板上生長24h後菌落呈現黑色，直徑為4mm，在其周圍形成一個黑色環，培養48h，菌落仍呈黑色，直徑2mm~3mm，除在菌落周圍有一環外，在菌落中心部位的深層也形成黑點。李斯特氏菌在PALCAM瓊脂平板上與在OXA瓊脂平板上的菌落相似。
在OXA瓊脂平板和PALCAM瓊脂平板上挑選5個或更多可疑菌落，接種於TSA-YE瓊脂平板上，純培養後進行鑒定。
6.5 鑒定
6.5.1 藍色菌落鑒定
用45°斜射光照射TSA-YE瓊脂平板，菌落呈現藍灰色到藍色，用標準菌株作為陽性對照，將純化後的菌落接種於TSB-YE肉湯，30℃培養24h，供生化等項目檢驗使用。
6.5.2 類型運動鏡檢
挑選在TSA-YE瓊脂平板上生長良好的菌落於潔淨載玻片上，用0.8%生理鹽水製成懸浮液，壓上蓋玻片，於顯微鏡下觀察，李斯特氏菌為短棒狀杆菌，可見輕微的旋轉翻滾。用標準菌株作為對照。
6.5.3 革蘭氏染色
按照GB/T4789，38-2003進行革蘭氏染色李斯特氏菌顯短杆狀革蘭氏陽性反應。
6.5.4 過氧化氨酶實驗
挑取TSA-YE平板上的菌落於潔淨載玻片上，滴加1滴3%過氧化氫（H2O2）溶液，李斯特氏菌呈過氧化氫酶陽性反應。
6.5.5 溶血實驗
將7%羊血瓊脂平板底麵劃分為20個~25個小格，每格刺種一個菌落，從每個TSA-YE瓊脂平板上至少挑取2個菌落刺種血平板，並刺種陽性對照菌（單核細胞增生李斯特氏菌利綿羊李斯特氏菌）和陰性對照菌（英諾克李斯特氏菌），30℃培養24h~48h，穿刺應剛剛透過瓊脂層，盡量避免接觸平板底部時太猛烈和和使瓊脂破裂，於明亮處進行觀察，單核細胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌在刺種點周圍產生窄小的透明β型溶血環，綿羊李斯特氏菌產生大的β型溶血環，其他李斯特氏菌種不產生溶血環，
6.5.6 動力試驗
將TSB-YE肉湯培養物穿刺接種於SIM半固體培養基，於室溫（20℃～25℃）培養48h,李斯特氏菌有動力，在半固體試管內呈典型傘狀生長。
6.5.7 硝酸鹽還原試驗
用TSB-YE肉湯培養物接種與硝酸鹽肉湯中，於35℃培養5d,加入0.2ml試劑A，再加入0.2ml試劑B,輕搖混合，如在1min～2min內出現紅色，判斷為陽性反應，如果沒有顏色顯現，在含有試劑A和試劑B的試管內再加入少量鋅粉，（約20mg）放置1h,如出現紅色，表示仍有硝酸鹽存在，未被細菌還原，判斷為陰性。
6.5.8 MR-VP試驗
將TSB-YE肉湯培養物接種與MR-VP肉湯中，於35℃培養48h，移取1ml培養物於潔淨試管中，加5%α-萘酚溶液0.3ml，在加4%氫氧化鉀溶液0.2ml，輕輕搖動試管約1min，靜置約20min，出現紅色為VP陽性反應，將剩餘培養液繼續與35℃培養48h，加甲基紅指示劑1滴於試管中，出現紅色為MR陽性反應，李斯特氏菌均為MR-VP陽性反應。
6.5.9 三糖鐵試驗
用TSB-YE肉湯培養物接種於三糖鐵瓊脂（TSI）,於35℃培養5d，李斯特氏菌在斜麵和底層產酸，不產硫化氫
6.5.10 糖發酵試驗
將TSB-YE肉湯培養物分別接種於0.5%葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、甘露醇、鼠李糖、木糖發酵管內，於35℃培養21h～48h,陽性繼續培養到第5天，李斯特氏菌不產氣，其不同菌種生化反應見表1：
6.5.11 尿素酶試驗
用TSB-YE肉湯培養物穿刺接種於尿素酶瓊脂斜麵上，於35℃培養5d，逐日觀察李斯特氏菌成尿素酶試驗陰性反應，斜麵無顏色變化
6.5.12 協同溶血試驗（caMP）
在羊血瓊脂平板上各劃一直線，使兩線平行，在兩平行線上分別接種β型溶血金黃色葡萄球菌
（S.aureus）ATCC4944和馬紅球菌（R.equi）, ATCC6939培養基，在該兩線之間垂直劃線接種待測菌培養基，與兩線相近但不相交，於35℃培養24h~48h後，觀察相交處溶血情況，單核細胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌（L.seeligeri）在靠近金黃色葡萄球菌接種點附近的的容血增強，可見有明顯的箭頭狀溶血現象，其他李斯特氏菌不產生溶血。
6.5.13 API鑒定試驗
API鑒定實驗可代替6.5.7~6.5.12試驗，具體方法；檢查6.5.1~6.5.4中符合李斯特氏菌特征的菌株，傳代分離於7%羊血瓊脂平板，按API Listerin鑒定係統說明書所述方法進行鑒定，應用說明書提供的數值編碼表得到鑒定結果。
6.5.4血清學檢驗
將TSB-YE肉湯培養基接種到3mlTSB-YE肉湯中，於35℃培養24h接種2支TSA-Y瓊脂斜麵，於35℃培養24h，用3ml. 0.01 mol/L磷酸鹽緩衝液將斜麵菌苔洗下，菌懸液於80℃水溶中加熱1h，以2500r/min離心30min，棄去2ml上清液，將剩餘液與沉澱混勻製成菌懸液血清學玻片凝集實驗，
李斯特氏菌菌種的血清型見表2
7 菌量控製
每次檢驗均需用標準陽性菌株和陰性菌株（如杆菌和鏈球菌等）進行質量控製，在6.2樣品置備的同時，在一個作為空白對照的FB1增菌液中加入新鮮配製的每毫升含有10個~100個單核細胞增生李斯特氏菌的陽性標準菌株培養物稀釋液1ml，和陰性菌株培養物，按檢驗程序進行同步檢驗。
8 報告結果
8.1 協同溶血試驗、血清學試驗可根據需要進行，常規檢驗可不進行這些試驗。
8.2 單核細胞增生李斯特氏菌與其他李斯特氏菌種的鑒別見表1
8.2.1 報告陽性結果：檢出單核細胞增生李斯特氏菌。
8.2.2 報告陰性結果：未檢出單核細胞增生李斯特氏菌。
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