出口食品中蠟樣芽孢杆菌檢驗方法
1主題內容與適用範圍
2本標準規定了出口食品中蠟樣芽孢杆菌的檢驗方法。
2 設備和材料
2.1 吸管：容量1.0mL和10.0mL,具0.1mL刻度。
2.2 菌落計數器。
2.3 均質器。
2.4 厭氧培養裝置。
2.5 渦動攪拌器。
2.6 L形玻璃棒。
2.7 恒溫培養箱: 30℃及36±1℃。
3 培養基和試劑
3.1 甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂(MYP)。
3.2 胰酪腖大豆多粘菌素肉湯。
3.3 酚紅葡萄糖肉湯。
3.4 硝酸鹽肉湯。
3.5 營養瓊脂。
3.6 L-酪氨酸營養瓊脂。
3.7 溶菌酶營養肉湯。
3.8 改良V-P培養基。
3.9 動力培養基。
3.10 胰酪腖大豆羊血瓊脂(TSSB)。
3.11 Butterfield氏磷酸鹽緩衝稀釋液。
3.12 亞硝酸鹽試劑。
3.13 V-P試劑。
3.14 堿性複紅染色液。
4 樣品的保存和送檢
待檢樣品應保持在6℃以下運送並盡可能不使其冷凍。送達實驗室後,應保存於4℃並
盡快進行檢驗。如在4d內不能進行檢驗,應將樣品儲存在-20℃,檢驗前再於室溫下解凍。
脫水食品可在常溫下送檢和儲存。
5 樣品的製備
5.1 以無菌操作用滅菌刀、剪將樣品剪碎。稱取50 g放於無菌均質杯中。
5.2 加450 mL無菌磷酸鹽緩衝稀釋液於均質杯中以18000～20000 r/min均質2min。製成
1 : 10樣品稀釋液。
5.3 取1: 10稀釋液10.0 mL加到含有90.0 mL無菌磷酸鹽緩衝液的稀釋瓶中,充分混勻製
成1 : 100的稀釋液。
5.4 每個稀釋度換用1支10.0mL滅菌吸管,按上述操作程序進行10倍遞增稀釋直至10**-6。
6 檢驗步驟
6.1 平板計數法
6.1.1 取各稀釋液0.1mL接種到MYP瓊脂平板上。用滅菌L形玻璃棒均勻塗布於整個瓊脂
表麵。每稀釋度接種兩個MYP瓊脂平板。
6.1.2 將平板置於30℃培養24 h。
6.1.3 選取具有15～150個典型或可疑蠟樣芽孢杆菌菌落的平板,進行計數。並計算同
一稀釋度兩個平板的平均菌落數。
蠟樣芽孢杆菌在MYP瓊脂平板上生成的菌落為微粉紅色,環繞產生卵磷脂酶沉澱環。
如反應不典型,可繼續培養24h再計數。
6.1.4 計數後,從每個平板至少選取5個已計數的菌落分別接種於營養瓊脂斜麵,於30℃
培養24 h,按第6章進行證實試驗。
6.1.5 根據證實試驗確定為蠟樣芽孢杆菌的菌落數,按比例計算出該皿內的蠟樣芽孢杆
菌菌落數,然後乘其稀釋倍數再乘以10,即得每克樣品所含蠟樣芽孢杆菌數並作出報告。
例:將檢樣10**-4稀釋液0.1mL塗布於MYP瓊脂平板上,生成的可疑菌落數為25個,取5個進
行鑒定,證實為蠟樣芽孢杆菌的是4個,則1 g樣品中蠟樣芽孢杆菌數為(25×4/5)×10**4
×10＝2×10**6。
6.2 最近似值(MPN)法
適用於汙染蠟樣芽孢杆菌數不大於10**3個/g的食品。
6.2.1 選用三管法MPN係列。取10**-1、10**-2、10**-3三種稀釋液,每種稀釋液接種3
管胰酪腖大豆多粘菌素肉湯,每管接種1mL。
6.2.2 置於30℃培養48±2 h。
6.2.3 從長菌的試管取培養物劃線接種到MYP瓊脂平板上。
6.2.4 置30℃培養24～48 h。
6.2.5 從MYP瓊脂平板上挑取粉紅色繞有沉澱環的單個菌落,接種營養瓊脂斜麵,置30℃
培養24 h,供作證實試驗。
6.2.6 根據證實試驗確定為蠟樣芽孢杆菌的管數,由MPN表 [附錄C(補充件)]計算蠟樣芽
孢杆菌的MPN值/g,並作出報告。
7 證實試驗
7.1 形態觀察
取營養瓊脂斜麵培養物,作革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽孢杆菌為革蘭氏陽性大杆菌,呈
短鏈或長鏈,芽孢呈橢圓形位於菌體中央或偏端,不使菌體脹大。
7.2 生化學性狀
7.2.1 葡萄糖發酵試驗
接種於酚紅葡萄糖肉湯中,厭氧條件下35℃培養24h。培養基應由紅色變為黃色(表明
本菌在厭氧條件下分解葡萄糖產酸)。
7.2.2 硝酸鹽還原試驗
接種於硝酸鹽肉湯中,35℃培養24h。加硝酸鹽試劑後應為陽性反應(紅色)。
7.2.3 V-P試驗
接種於改良V-P培養基中,35℃培養48 h。加V-P試劑及肌酸數粒,靜止1h,應為陽性
反應(伊紅色)。
7.2.4 L-酪氨酸分解試驗
接種於L-酪氨酸瓊脂培養基上,35℃培養48 h,陽性反應菌落周圍培養基應出現澄清
透明區(表示產生酪蛋白酶)。陰性時應繼續培養72 h再觀察。
7.2.5 溶菌酶試驗
用直徑2mm接種環取純菌懸液一環,接種於溶菌酶肉湯中,35℃培養24h。該菌在本培
養基(含0.001％的溶菌酶)中能生長。如出現陰性反應,應繼續培養24 h。
7.2.6 卵磷脂酶試驗
接種於MYP瓊脂平板上,35℃培養24 h。陽性反應菌落周圍應出現沉澱環(表示產生卵
磷脂酶)。
7.3 蠟樣芽孢杆菌與類似菌的鑒別試驗
7.3.1 動力試驗
用接種針挑取培養物穿刺接種於動力培養基中,30℃培養24h。有動力蠟樣芽孢杆菌
應沿穿刺線呈擴散生長,而蕈狀芽孢杆菌常常呈絨毛狀生長,形成所謂的蜂巢狀擴散。也
可用懸滴法檢查。蠟樣芽孢杆菌和蘇雲金芽孢杆菌通常運動極為活潑,而炭疽杆菌則不運
動。
7.3.2 根狀生長試驗
用接種環取培養物接種於營養瓊脂平板上,30℃培養18～24h。蠟樣芽孢杆菌群的多
數菌株形成粗糙的似毛玻璃狀或融蠟狀的菌落。其中唯獨蕈狀芽孢杆菌則形成根狀生長
的特征。
7.3.3 溶血試驗
取培養物接種於胰酪腖大豆羊血瓊脂平板上,30～32℃培養24h。蠟樣芽孢杆菌落周
圍呈現β型完全溶血的溶血環。蘇雲金芽孢杆菌和蕈狀芽孢杆菌呈現弱的溶血現象,而
炭疽芽孢杆菌通常為不溶血。
7.3.4 蛋白質結晶毒素試驗
取經30℃培養24h並於室溫放置2～3d的營養瓊脂培養物少許於載玻片上,滴加蒸餾
水混塗成薄膜。經自然幹燥,微火固定後,於塗膜加甲醇半分鍾後傾掉,再通過火焰幹燥,
於載片上滴滿0.5％堿性複紅液,放火焰上加熱微見蒸氣(勿使染液沸騰)後持續1.5min,
移去火焰,使載片放置0.5min再傾去染液。用潔淨自來水徹底清洗、晾幹、鏡檢。觀察
有無遊離芽孢和染成黑色的菱形毒素結晶體。如發現遊離芽孢形成的不豐富,應將培養
物置室溫2～3d再行檢查。蘇雲金芽孢杆菌用此法檢測為陽性,而蠟樣芽孢杆菌群的其
他菌種則為陰性。
7.3.5 結果解釋及報告
符合蠟樣芽孢杆菌群的特征,有活潑的動力,很強的溶血能力,不形成根狀生長和不
產生蛋白結晶毒素,可報告為蠟樣芽孢杆菌。
對偶爾遇到的一些少數可疑菌株,可以根據需要進行其他試驗,如青黴素酶、噬菌
體試驗等。
附 錄 A
培 養 基 製 備
(補充件)
A1 甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養基(MYP)
a. 基礎瓊脂
牛肉膏 1.0g
蛋白腖 10.0g
D-甘露醇 10.0g
氯化鈉 10.0g
瓊 脂 15.0g
酚 紅 0.025g(配成溶液加入)
蒸餾水 稀釋至900mL
b. 50％卵黃液 50mL
c. 多粘菌素B 100 IU/mL
將a.中的前5種成分加入蒸餾水中加熱溶解,校正pH至7.2±0.1,加入酚紅溶液,混勻
後分裝燒瓶中,每瓶225 mL。121℃高壓滅菌15min。用時加熱溶化,冷至50℃後每瓶加入
50％卵黃液12.5mL和2.5mL多粘菌素B溶液,混勻後傾注滅菌平皿,每皿15～18mL。用前應
將平板置室溫約24 h。
注：①50％卵黃液：取鮮雞蛋,用硬刷將蛋殼徹底洗淨,瀝幹,放於70％酒精溶液中
浸泡1 h。以無菌操作取出卵黃,加入等量滅菌生理鹽水,混勻後備用。
②多粘菌素B溶液：在50mL滅菌蒸餾水中溶解500 000國際單位的無菌硫酸鹽多
粘菌素B。
A2 胰酪腖大豆多粘菌素肉湯
胰酪腖 17.0g
植物腖 3.0g
氯化鈉 5.0g
磷酸氫二鉀 2.5g
葡萄糖 2.5g
蒸餾水 稀釋至1000mL
pH7.3±0.1
將上述各成分溶解在蒸餾水中,煮沸2min,分裝大試管,每管15 mL,121℃高壓滅菌
15min。臨用時每管加入0.5％多粘菌素B溶液0.1mL混勻即可。
注：多粘菌素B溶液：在33.3mL滅菌蒸餾水中溶解500 000國際單位無菌硫酸鹽多粘
菌素B。
A3 酚紅葡萄糖肉湯
(月示)腖 10.0g
牛肉膏 1.0g
氯化鈉 5.0g
葡萄糖 5.0g
酚 紅 0.018g(配成溶液加入)
蒸餾水 稀釋至1000mL
pH7.4±0.1
將除酚紅外的各成分溶解於蒸餾水並稀釋至1000mL。校正pH後加入酚紅溶液,混勻,
分裝試管,每管3 mL。121℃高壓滅菌10min備用。最終pH7.4±0.1
A4 硝酸鹽肉湯
牛肉膏 3.0g
蛋白腖 5.0g
硝酸鉀 1.0g
蒸餾水 稀釋至1000mL
pH7.0±0.1
將上述各成分溶解於蒸餾水並稀釋至1000mL。校正pH後分裝試管,每管5mL,121℃高
壓滅菌15min。
A5 營養瓊脂
牛肉膏 3.0g
蛋白腖 5.0g
瓊 脂 稀釋至1000mL
pH7.2±0.1
將各成分於蒸餾水中加熱溶解。校正pH後分裝試管,每管5～7mL；或分裝燒瓶,每瓶
100～150mL。121℃高壓滅菌15 min。將試管取出,製成斜麵；如製平板,可將滅菌的瓊
脂冷至45～50℃傾注滅菌平皿,每皿18～20mL。
A6 L-酪氨酸營養瓊脂
營養瓊脂 100mL
5％滅菌L-酪氨酸懸液 10mL
將100mL營養瓊脂溶化,冷至45℃,加入5％的滅菌L-酪氨酸懸液10mL,充分混勻後,
分裝試管,每管3.5mL。製成的斜麵應迅速冷卻防止L-酪氨酸分離而出。
注：L-酪氨酸懸液：將0.5g酪氨酸加10mL蒸餾水混勻,121℃高壓滅菌15min。
A7 溶菌酶營養肉湯
牛肉膏 3.0g
蛋白腖 5.0g
蒸餾水 稀釋至1000mL
0.1%溶菌酶溶液 10.0mL
pH6.8±0.1
將上述成分(溶菌酶溶液除外)溶解於蒸餾水並稀釋至1000mL。校正pH後,分裝於燒
瓶中,每瓶99mL。121℃高壓滅菌15min。於每瓶中加入0.1％溶菌酶溶液1mL,混勻後分裝
滅菌試管,每管2.5mL。
注：溶菌酶溶液：在65mL滅菌的0.1mol/L鹽酸中加0.1g溶菌酶。煮沸20min溶解後,
再用滅菌的0.1mol/L 鹽酸稀釋至100mL。
A8 改良 V-P培養基
(月示)蛋白腖 7.0g
葡萄糖 5.0g
氯化鈉 5.0g
pH6.5±0.1
將上述各成分溶解於蒸餾水並稀釋至1000 mL。校正pH後分裝試管,每管5mL。121℃
高壓滅菌10 min備用。
A9 動力培養基
胰酪腖 10.0g
酵母膏 2.5g
葡萄糖 5.0g
磷酸氫二鈉 2.5g
瓊 脂 3.0g
蒸餾水 稀釋至1000mL
pH7.4±0.2
將上述各成分於蒸餾水加熱溶解並稀釋至1000 mL。校正pH後,分裝試管,每管2mL。
121℃高壓滅菌10 min備用。
A10 胰酪腖大豆羊血瓊脂(TSSB)
胰酪腖 15.0g
植物腖 5.0g
氯化鈉 5.0g
瓊 脂 15.0g
蒸餾水 稀釋至1000mL
pH7.0±0.2
將上述各成分於蒸餾水中加熱溶解。校正pH後,分裝燒瓶,每瓶100mL。121℃高壓滅
菌15min。水浴中冷至45～50℃加入5mL無菌脫纖維羊血,混勻後傾注平板,每皿18～20mL。
附 錄 B
試 劑 配 製
(補充件)
B1 Butterfield氏磷酸鹽緩衝稀釋液
在500mL蒸餾水中溶解磷酸二氫鉀(KH2PO4) 34.0g,用1mol/L氫氧化鈉溶液約175mL校
正pH至7.2,再用蒸餾水稀釋至1000 mL,製成儲存液於冰箱中儲存。取原液1.25mL,用蒸
餾水稀釋至1000 mL。分裝試管,每管90 mL,121℃高壓滅菌15 min。
B2 亞硝酸鹽試劑
a. 試劑A：對氨基苯磺酸8.0g,溶解於5mol/L,乙酸1000 mL中。
b. 試劑B：α-萘酚2.5g溶解於5mol/L乙酸1000 mL中。
B3 V-P試劑
a. 5％α-萘酚溶液：取α-萘酚5.0g溶解於100 mL無水乙醇中。
b. 40％氫氧化鉀溶液：將氫氧化鉀40 g於蒸餾水中溶解並稀釋至100 mL。
c. 肌氨酸結晶。
B4 堿性複紅染色液
取堿性複紅0.5g溶解於20mL乙醇中,再用蒸餾水稀釋至100mL,濾紙過濾後儲存備用。
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