中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準
出口食品副溶血性弧菌檢驗方法 SN 0173—92 代替ZB X04 002—86
1 主題內容與適用範圍
本標準規定了海產食品中副溶血性弧菌檢驗方法。
本標準適用於海產食品中副溶血性弧菌檢驗,其他食品可參照使用。
2 設備與材料
2.1 試管:17mm×170mm、15mm×150mm、10mm×100mm。
2.2 吸管:1mL、10mL。
2.3 培養皿:直徑90mm。
2.4 廣口瓶或三角瓶。
2.5 電動均質器。
2.6 電動試管振蕩器。
2.7 37℃恒溫箱。
2.8 42℃恒溫水浴箱。
2.9 試管架。
3 培養基及試劑
3.1 30g/L氯化鈉稀釋液:見9.1。
3.2 60g/L氯化鈉蛋白腖水(PW):見9.2。
3.3 氯化鈉多粘菌素B肉湯(SPB):見9.3。
3.4 硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、膽鹽、蔗糖瓊脂(TCBS):見9.4。
3.5 氯化鈉三糖鐵瓊脂(TSI):見9.5。
3.6 嗜鹽性試驗用胰腖水(TB):見9.6。
3.7 胰腖大豆瓊脂斜麵(TSA):見9.7。
3.8 靛基質試驗用培養基(I):見9.8。
3.9 氨基酸試驗用培養基:見9.9。
3.10 V-P半固體瓊脂(VP):見9.10。
3.11 糖類分解試驗用培養基:見9.11。
3.12 42℃生長試驗用培養基:見9.12。
3.13 O/F試驗用培養基(HLGB):見9.13。
3.14 神奈川現象試驗用我妻氏瓊脂(WA):見9.14。
4 樣品製備
4.1 冷凍樣品應在45℃以下不超過15min或在2～5℃不超過18 h解凍。若不能及時檢驗,
應放於—15℃左右保存；非冷凍而易腐的樣品應盡可能及時檢驗,若不能及時檢驗,應置於6～10℃冰箱保存,在24 h內檢驗。
4.2 取樣:以無菌操作進行。
4.2.1 魚類:取魚體不同部位。
4.2.2 貝類:取內髒或含內髒的全部貝肉；如為帶殼貝類,則應先在清潔的流水中洗刷淨外殼,然後以無菌操作打開貝殼,取出內髒或含內髒的全部貝肉和貝液。
4.2.3 甲殼類:取包括鰓及腸的部分或整體。
4.3 以無菌操作稱取50 g檢樣放於均質杯中,以滅菌剪刀充分剪碎。
4.4 加30 g/L氯化鈉稀釋水450mL,均質(8 000 r/min)1min,使成1:10稀釋液(如無均質器,則應以剪刀盡量剪碎,加450mL稀釋水使成1:10稀釋液,並充分振蕩)。
4.5 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入裝有9mL30 g/L氯化鈉稀釋水的試管內,振搖試管混合均勻,製成1:100稀釋液。
4.6 每一稀釋度換取1支1 mL滅菌吸管,按上項操作順序進行10倍遞增稀釋。稀釋倍數要依據有關標準、規定、要求或樣品汙染情況而定。
5 增菌培養和分離
5.1 對新鮮樣品,可選擇3個連續適宜的稀釋度,分別以1mL無菌吸管各吸取1mL稀釋液, 接種10mL單料氯化鈉多粘菌素B肉湯中,進行選擇性增菌培養,每一稀釋度接種3 管(若選擇的稀釋度為接種1g樣品時,則應以10mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液10 mL,接種10 mL雙料氯化鈉多粘菌素B肉湯中)。對經加熱、輻射處理或冷藏、凍結的樣品,可按以上操作先將樣品接種於60 g/L氯化鈉蛋白腖水於37℃前增菌18～24h,然後將培養物以接種環轉種到氯化鈉多粘菌素B肉湯中進行選擇性增菌。
5.2 37℃培養18～24 h。
5.3 氯化鈉多粘菌素B肉湯管如有菌生長,則以3 mm直徑接種環分別取一環菌液,劃線於硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、膽鹽、蔗糖瓊脂(TCBS)平板上。
5.4 37℃培養18～24 h。
5.5 副溶血性弧菌在蔗糖瓊脂(TCBS)平板上的典型菌落呈圓形,邊緣整齊、濕潤、稍混濁、半透明,多數具尖心、鬥笠狀,藍綠色菌落,直徑2～4mm。
6 生化鑒定
6.1 在蔗糖瓊脂(TCBS)平板上如出現典型或可疑菌落,每個平板至少挑取兩個菌落,每個菌落分別順次接種到下列培養基進行鑒別試驗。
6.1.1 無鹽胰腖水。
6.1.2 30g/L氯化鈉胰腖水。
6.1.3 氯化鈉三糖鐵瓊脂:先穿刺後劃線。
6.2 37℃培養18～24 h。
6.3 選取在氯化鈉三糖鐵斜麵上產堿,在底層產酸,不產氣,不產硫化氫；在無鹽胰腖水中幾乎不生長,在30 g/L氯化鈉胰腖水中生長旺盛的菌株進行革蘭氏染色、鏡檢,副溶血性弧菌為革蘭氏陰性,呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態,兩端濃染、無芽胞。如符合, 繼續進行以下生化鑒定。
6.3.1 嗜鹽性試驗:各取一環30g/L氯化鈉胰腖水培養物,分別接種到70g/L及100g/L氯化鈉胰腖水中,37℃培養18～24 h。
6.3.2 細胞色素氧化酶試驗:取一環30g/L氯化鈉胰腖水培養物劃線到胰腖大豆瓊脂斜麵上,37℃培養18～24 h。
6.3.3 靛基質試驗:在6.1.2的30 g/L氯化鈉胰腖水培養物中加靛基質試劑後觀察反應。
6.3.4 賴氨酸脫羧酶試驗:由氯化鈉三糖鐵斜麵以接種針取少許培養物接種到賴氨酸試驗用培養基中,37℃培養18～24 h。
6.3.5 精氨酸雙水解酶試驗:按上項同樣操作,將培養物接種到精氨酸試驗用培養基中, 37℃培養18～24h。
6.3.6 V-P試驗:以接種針由氯化鈉三糖鐵斜麵取少許培養物穿刺V-P半固體瓊脂,37℃培養18～24h。在加V-P試劑前應先觀察動力。沿穿刺線周圍呈擴散性生長為動力陽性。
6.4 副溶血性弧菌生化特性的判定及進一步試驗如下。
6.4.1 如所分離的菌株符合表1特性,按第7章報告結果。
表1 副溶血性弧菌的生化特性
鑒定程序 生 化 項 目 反應
初 篩 氯化鈉三糖鐵
斜麵 產堿
底層 產酸,不產氣
硫化氫 陰性
嗜鹽性
無鹽胰腖水 幾乎不生長
30 g/L氯化鈉胰腖水 生長旺盛
生化鑒別 70 g/L氯化鈉胰腖水 明顯生長
100 g/L氯化鈉胰腖水 幾乎不生長
靛基質 陽性
V-P 陰性
動力 陽性
細胞色素氧化酶 陽性
賴氨酸脫羧酶 陽性
精氨酸雙水解酶 陰性
擴大生化鑒別 42℃生長 陽性
蔗糖 不分解
O/F試驗 發酵型
6.4.2如表1生化項目(擴大生化試驗項目除外)中,僅有一項生化試驗不符合時,按以下步驟做進一步鑒定
6.4.2.1 蔗糖分解試驗,42℃生長試驗,O/F試驗。如仍符合副溶血性弧菌特性,可按第 7章報告結果,如其中有一項不符合,即可排除。
6.4.2.2 副溶血性弧菌與有關細菌的鑒別可參考表2進行。
表2 副溶血性弧菌與有關細菌鑒別表
試驗 副溶血性弧菌 溶藻膠
弧 菌 鰻弧菌 創傷
弧菌 河弧菌 麥氏弧菌 嗜水氣單胞菌 類誌賀鄰
單胞菌
TCBS(藍綠色菌落) + - - + - - - +
42℃生長 + + - v v - -
鹽耐受性試驗(生長)
0％氯化鈉 - - - - - - + +
60g/L氯化鈉 + + + + + + - -
80g/L氯化鈉 + + v - + v - -
100g/L氯化鈉 - + - - - - - -
賴氨酸脫羧酶 + + - + - v - +
精氨酸雙水解酶 - - v - + + v +
鳥氨酸脫羧酶 + v - v - - - v
蔗糖發酵 - + + - + + v -
乳糖發酵 - - - + - v v v
甘露醇發酵 + + + v + + + -
阿拉伯糖發酵 + - - - + - v -
V-P試驗 - + v - - + v -
注:空白處表示未試驗；ｖ表示可變的。
7 報告結果
生化試驗符合副溶血性弧菌特性的菌株,按增菌培養陽性管數,應用表3(3管法),查出每100
g樣品中的副溶血性弧菌MPN值。檢驗結果報告為每100g樣品中副溶血性弧菌的最近似值為××個。 表3 每克樣品中的最近似值(3管法MPN)
━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━
陽 性 管 數 ┃ ┃ 陽 性 管 數 ┃
━━━━━━━━━┫ MPN ┣━━━━━━━━━━┫ MPN
0.1 0.01 0.001 ┃ ｜ 0.1 0.01 0.001 ┃
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
0 0 0 ┃ ＜3 ┃ 2 0 0 ┃ 9.1
0 0 1 ┃ 3 ┃ 2 0 1 ┃ 14
0 0 2 ┃ 6 ┃ 2 0 2 ┃ 20
0 0 3 ┃ 9 ┃ 2 0 3 ┃ 26
0 1 0 ┃ 3 ┃ 2 1 0 ┃ 15
0 1 1 ┃ 6.1 ┃ 2 1 1 ┃ 20
0 1 2 ┃ 9.2 ┃ 2 1 2 ┃ 27
0 1 3 ┃ 12 ┃ 2 1 3 ┃ 34
0 2 0 ┃ 6.2 ┃ 2 2 0 ┃ 21
0 2 1 ┃ 9.3 ┃ 2 2 1 ┃ 28
0 2 2 ┃ 12 ┃ 2 2 2 ┃ 35
0 2 3 ┃ 16 ┃ 2 2 3 ┃ 42
0 3 0 ┃ 9.4 ┃ 2 3 0 ┃ 29
0 3 1 ┃ 13 ┃ 2 3 1 ┃ 36
0 3 2 ┃ 16 ┃ 2 3 2 ┃ 44
0 3 3 ┃ 19 ┃ 2 3 3 ┃ 53
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
1 0 0 ┃ 3.6 ┃ 3 0 0 ┃ 23
1 0 1 ┃ 7.2 ┃ 3 0 1 ┃ 39
1 0 2 ┃ 11 ┃ 3 0 2 ┃ 64
1 0 3 ┃ 15 ┃ 3 0 3 ┃ 95
1 1 0 ┃ 7.3 ┃ 3 1 0 ┃ 43
1 1 1 ┃ 11 ┃ 3 1 1 ┃ 75
1 1 2 ┃ 15 ┃ 3 1 2 ┃ 120
1 1 3 ┃ 19 ┃ 3 1 3 ┃ 160
1 2 0 ┃ 11 ┃ 3 2 0 ┃ 93
1 2 1 ┃ 15 ┃ 3 2 1 ┃ 150
1 2 2 ┃ 20 ┃ 3 2 2 ┃ 210
1 2 3 ┃ 24 ┃ 3 2 3 ┃ 290
1 3 0 ┃ 16 ┃ 3 3 0 ┃ 240
1 3 1 ┃ 20 ┃ 3 3 1 ┃ 460
1 3 2 ┃ 24 ┃ 3 3 2 ┃ 1100
1 3 3 ┃ 29 ┃ 3 3 3 ┃＞1100
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注:當報告每100g樣品中副溶血性弧菌的最近似值時,可將查表所得數字乘以100。
8 神奈川現象及血清學實驗(根據需要進行)
8.1 神奈川現象試驗
8.1.1 以接種環將30g/L氯化鈉胰腖水培養物點種於充分幹燥的我妻氏血瓊脂平板上。可先在平板背麵以玻璃鉛筆劃出若幹小區,使一個平板能做多個試驗。
8.1.2 37℃培養18～24h。
8.1.3 在24 h以內觀察結果,陽性結果在菌落周圍有一清晰的透明環。
8.2 血清學鑒定:副溶血性弧菌的抗原分為O、K、H三種。血清學分型以O及K抗原進行鑒定。
8.2.1 K 抗原凝集試驗
8.2.1.1 將經生化試驗證實為副溶血性弧菌的菌株轉種在兩支30g/L氯化鈉普通瓊脂斜麵上,37℃培養18 h。
8.2.1.2 以2mL 20g/L氯化鈉溶液洗下一支瓊脂斜麵培養物,製成濃厚菌懸液。
8.2.1.3 先以K多價抗血清與菌懸液進行玻片凝集試驗。在1min內觀察反應。陽性凝集者,另進行自然凝集試驗,若自然凝集試驗為陰性,再以該K多價抗血清中的單因子K抗血清進行試驗。
8.2.1.4 與單因子K抗血清出現陽性凝集的,為該菌株的相應K抗原。 8.2.2 O抗原凝集試驗
8.2.2.1 以20g/L氯化鈉〔含5％(V/V)甘油〕溶液洗另一支瓊脂斜麵培養物,將菌懸液經 121℃高壓滅菌1 h。
8.2.2.2 以離心沉澱法去上清液,再以20 g/L氯化鈉溶液4000r/min離心15 min,洗兩次沉澱後加0.5mL 2％氯化鈉溶液製成濃厚的菌懸液。
8.2.2.3 以已知K 抗原對應的O 群抗血清進行玻片凝集試驗,同時以20 g/L氯化鈉溶液代替抗血清做自然凝集對照試驗。
8.2.2.4 與抗血清出現強陽性凝集的,為該菌株的O抗原。
8.2.3 根據以上血清學試驗結果,可報告為發現副溶血性弧菌O×K×血清型。
9 培養基及試劑
9.1 30 g/L氯化鈉稀釋液
氯化鈉 30.0g;
蒸餾水1000mL
加熱溶解,調至pH7.0,121℃高壓滅菌15 min,以無菌操作分裝於500mL廣口瓶或500mL三角瓶,每瓶450 mL以及17mm×170mm試管,每管9mL,做稀釋樣品用。
9.2 60 g/L 氯化鈉蛋白腖水(PW)
蛋白腖 10.0g
氯化鈉 60.0g
蒸餾水 1000mL
將各成分加熱溶解,調至pH7.2,分裝於17mm×170mm試管,每管10mL。120℃高壓滅菌15min。
9.3 氯化鈉多粘菌素B肉湯(SPB)
酵母浸膏 3.0g
蛋白腖 10.0g
氯化鈉 20.0g
多粘菌素B 250單位/毫升培養基
蒸餾水 1000mL
將各成分(除多粘菌素B外)加熱溶解,稍冷後加入多粘菌素B,調至pH7.4。分裝於17mm ×170mm試管,每管10mL。121℃高壓滅菌15min。滅菌後,立即將培養基取出放涼。
9.4 硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、膽鹽、蔗糖瓊脂(TCBS)
酵母浸膏 5.0g
蛋白腖 10.0g
氯化鈉 10.0g
檸檬酸鈉 10.0g
硫代硫酸鈉 10.0g
膽酸鈉(以牛膽酸鈉代替) 3.0g
牛膽汁粉(以混合膽鹽代替) 5.0g
蔗 糖 20.0g
檸 檬酸鐵 1.0g
瓊 脂 18.0g
溴麝香草酚藍 0.04g
麝香草酚藍 0.04g
蒸餾水 1000mL
除指示劑外,將各種成分加熱溶解,調至pH8.6,加入指示劑。此培養基不必高壓滅菌,煮沸1～2min,待培養基稍涼後傾注平板。 在該平板上,溶藻膠弧菌為黃色菌落,而副溶血性弧菌為藍綠色菌落。腸球菌、變形菌及大腸菌群有時也會生長,但其菌落一般較小,易與副溶血性弧菌區別。
9.5 氯化鈉三糖鐵瓊脂(TSI)
牛肉浸膏 3.0g
蛋白腖 20.0g
乳 糖 10.0g
蔗 糖 10.0g
葡萄糖 1.0g
硫酸亞鐵 0.5g
硫代硫酸鈉 0.5g
氯化鈉 30.0g
瓊 脂 12.0g
酚 紅 0.024g
除瓊脂和酚紅外,將其他成分用蒸餾水400mL微火加熱溶解,同時將瓊脂置於600mL蒸餾水中,浸泡數分鍾後,加熱煮沸使完全溶解。然後將以上兩液混合均勻。調至pH7.4, 加入指示劑混勻,分裝於15mm×0mm試管,每管3～4mL,115℃高壓滅菌15min。滅菌後擺成斜麵,使高層和斜麵各約3cm。
9.6 嗜鹽性試驗用胰腖水(TB)
胰 腖 40.0g
酵母浸膏 12.0g
蒸餾水 4000mL
完全溶解後,分成4份,其中3份分別加入30g、70g、100g氯化鈉,使成0％、30g/L、 70g/L、00g/L不同濃度的氯化鈉胰腖水。調至pH7.5。分裝15mm×150mm試管,每管7mL。 121℃高壓滅菌15min。
9.7 胰腖大豆瓊脂斜麵(TSA)
胰 腖 15.0g
植物蛋白腖 5.0g
氯化鈉 30.0g
瓊 脂 15.0g
蒸餾水 1000mL
將各成分加入水中,要不斷攪拌,加熱至煮沸1min。分裝於15mm×150mm試管,每管 3mL。121℃高壓滅菌15min後製成斜麵,最終pH7.3±0.2。
試劑: 10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液
10g/Lα-萘酚乙醇溶液
將配好後的10g/L鹽酸四甲基對苯二胺溶液置於密塞棕色玻璃瓶中,於5～10℃存放。此試劑極易氧化,宜現用現配。試驗時,取37℃18～24h的胰腖大豆瓊脂斜麵培養物1支。將兩種試劑各2～3滴從斜麵上端流下,2min內呈現藍色者為細胞色素氧化酶試驗陽性。
9.8 靛基質試驗用培養基(I)
培養基同9.6的30g/L氯化鈉胰腖水。
靛基質試劑〔柯凡克(KOVAS)氏試劑〕:
對二甲氨基苯甲醛 10.0g
純戊醇 150.0mL
濃鹽酸 60.0mL
將試劑溶於戊醇中,然後慢慢加鹽酸,加熱至60℃後,呈深黃色,靜置6～7h,變成黃色即可使用。試液宜小量配製,冰箱保存。久存後,試液變為黃褐色,不可繼續使用。 在30g/L氯化鈉胰腖水18～24h培養液中,滴加柯凡克試液0.1mL。出現紅色環者為陽性,出現黃棕色環者為陰性。
9.9 氨基酸試驗用培養基
9.9.1 賴氨酸脫羧酶培養基(LD)
酵母浸膏 3.0g
葡萄糖 1.0g
氯化鈉 30.0g
L-賴氨酸 5.0g
溴甲酚紫 0.016g
蒸餾水 1000mL
除溴甲酚紫外,將各成分加入蒸餾水中,攪拌均勻,靜置約10min,加熱至完全溶解,調至pH6.7±0.1。分裝於10mm×100mm試管,每管1mL。121℃高壓滅菌10min。滅菌後應立即取出放涼,接種培養後,培養基顏色變為深紫色的為陽性反應,變為黃色的,為陰性反應。
9.9.2 精氨酸雙水解酶試驗用培養基(AD)
基礎培養基同賴氨酸脫羧酶試驗用培養基,精氨酸加入量同賴氨酸量。
9.10 V-P半固體瓊脂(VP)
酵母浸膏 1.0g
蛋白腖 12.0g
葡萄糖 10.0g
氯化鈉 30.0g
瓊 脂 3.0g
蒸餾水 1000mL
將各成分加入蒸餾水中,靜置約10 min,攪拌、加熱至溶解。調pH7.3±0.1,分裝於 10mm×100mm試管,每管1mL,121℃高壓滅菌10min。滅菌後,立即取出放涼。
V-P試劑:
甲液:α-萘粉 6.0g
純乙醇 100.0mL
乙液:氫氧化鉀 40.0g
肌 酸 0.3g
蒸餾水 100.0mL
先將氫氧化鉀溶於水中,再加入肌酸。
以上試劑保存於冰箱中,可使用兩個月。試驗時,分別加甲液0.2mL(約6滴)和乙液 0.1mL(約3滴)。加入試劑後呈現紅色者為陽性,銅色為陰性。對陰性結果1h後再做一次檢查。
9.11 糖類分解試驗用培養基
蛋白腖 10.0g
牛肉浸膏 3.0g
氯化鈉 30.0g
溴甲酚紫 0.04g
蒸餾水 1000mL
除溴甲酚紫外,將各成分加熱溶解,按1％量加入糖類。調至pH7.0±0.2,加入溴甲酚紫。分裝於10mm×100mm試管,每管1mL,112℃高壓滅菌15min。
9.12 42℃生長試驗用培養基
胰 腖 17.0g
大豆腖 3.0g
氯化鈉 30.0g
磷酸氫二鉀 2.5g
葡萄糖 2.5g
蒸餾水 1000mL
除葡萄糖外,將各種成分混合溶解,煮沸1～2min,加入葡萄糖。調至pH7.3±0.2。分裝於15mm×150mm試管,每管7mL,121℃高壓滅菌15min。
9.13 O/F試驗用培養基(HLGB)
蛋白腖 2.0g
酵母浸膏 0.5g
氯化鈉 30.0g
葡萄糖 10.0g
溴甲酚紫 0.015g
瓊 脂 3.0g
蒸餾水 1000mL
將各成分(除溴甲酚紫外)加於蒸餾水中加熱溶解,調至pH7.4,加入溴甲酚紫,混勻, 分裝於15mm×150mm試管,每管3mL,121℃高壓滅菌15min。
本培養基用於鑒別革蘭氏陰性細菌對於葡萄糖的發酵型和氧化型代謝作用。將同一菌株接種於2
支該培養基中,其中一支管的培養基上麵加滅菌礦物油脂來隔離氧氣,而另一支管不加。這樣發酵型細菌在兩管培養基中均產生酸性反應,氧化型細菌則在未加礦物油脂的管中產生酸性反應,而在加油脂的培養管中隻有輕度或者不生長也無反應變化。
9.14 神奈川現象試驗用我妻氏瓊脂(WA)
酵母浸膏 3.0g
蛋白腖 10.0g
氯化鈉 70.0g
磷酸氫二鉀 5.0g
甘露醇 10.0g
結晶紫 0.001g
瓊 脂 15.0g
蒸餾水 1000mL
調至pH8.0(不必高壓),加熱30 min,待冷至50℃,按5％的體積輕輕加入事先準備好的以生理鹽水洗三次的新鮮人或兔血球。混合均勻傾注平皿,充分幹燥後使用 。
注:新製備的培養基均應用已知陽性及陰性菌進行測試,以保證培養基質量。
如要求一定量樣品中不得有副溶血性弧菌,則可將樣品接種於9倍量的60g/L氯化鈉蛋白腖水(前增菌)或多粘菌素B肉湯(直接增菌),以下操作按上列程序進行。
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