1 主題內容與適用範圍
本標準規定了食品中致瀉大腸埃希氏菌的檢驗方法。
本標準適用於食品和食物中毒樣品中致瀉大腸埃希氏菌的檢驗。
2 引用標準
GB 4789.28 食品衛生微生物學檢驗 染色法、培養基和試劑
3 設備和材料
3．1 平天：稱取檢樣用。
3．2 均質器或乳缽。
3．3 溫箱：36±1℃，42℃。
3．4 水浴：100℃，65～68℃，50℃。
3．5 顯微鏡。
3．6 離心機。
3．7 酶標儀。
3．8 細菌濃度比濁管：Mac Farland3 號。
3．9 滅菌廣口瓶：500 mL。
3．10 滅菌三角燒瓶：500 mL，250 mL。
3．11 滅菌平皿：90 mm×15 mm。
3．12 滅菌試管：10 mm×75 mm。
3．13 滅菌吸管：1 mL，5 mL。
3．14 橡皮乳頭。
3．15 載玻片。
3．16 酒精燈。
3．17 滅菌金屬匙或玻璃棒。
3．18 接種棒，鎳鉻絲。
3．19 試管架，試管簍。
3．20 冰箱。
3．21 注射器 0.25 mL，連接內徑為 1 mm 塑料小管一段。
3．22 滅菌的刀子、剪子、鑷子。
3．23 小白鼠：1～4 目齡。
3．24 硝酸纖維素濾膜150 mm×50 mmΦ0.45 um。臨用時切成兩張，每張75 mm
×50 mm，用鉛筆劃格，每格 6 mm×6 mm，每行 10 格，分 6 行。滅菌備用。
4 培養基和試劑
4．1 乳糖膽鹽發酵管：按 GB 4789.28 中 4.9 規定。
4．2 營養肉湯：按 GB 4789.28 中 4.8 規定。
4．3 腸道菌增菌肉湯：按 GB 4789.28 中 4.18 規定。
4．4 麥康凱瓊脂：按 GB 4789.28 中 4.24 規定。
4．5 伊紅美藍瓊脂（EMB）：按 GB 4789.28 中 4.25 規定。
4．6 三糖鐵瓊脂（TSI）：按 GB 4789.28 中 4.26,4.27 規定。
4．7 克氏雙糖鐵瓊脂（KI）：按 GB 4789.28 中 4.28,4.29 規定。
4．8 糖發酵管（乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇） ：按GB 4789.28中3.2規定。
4．9 賴氨酸脫羧酶試驗培養基：按 GB 4789.28 中 3.12 規定。
4．10 尿素瓊脂（pH7.2）；按 GB 4789.28 中 3.16 規定。
4．11 氰化鉀（KCN）培養基；按 GB 4789.28 中 3.16 規定。
4．12 蛋白腖水、靛基質試劑：按 GB 4789.28 中 3,13 規定。
4．13 半固體瓊脂：按 GB 4789.28 中 4.30 規定。
4．14 Honda 氏產毒肉湯：按 GB 4789.28 中 4.34 規定。
4．15 Elek 氏培養基：按 GB 4789.28 中 4,35 規定。
4．16 氧化酶試劑：按 GB 4789.28 中 3.18 規定。
4．17 革蘭氏染色液：按 GB 4789.28 中 2.2 規定。
4．18 致病性大腸埃希氏菌診斷血清、侵襲性大腸埃希氏菌診斷血清、產腸毒
素大腸埃希氏菌診斷血清、出血性大腸埃希氏菌診斷血清。
4．19 產腸毒素大腸埃希氏菌 LT 和 ST 酶標診斷試劑盒。
4．20 產腸毒素 LT 和 ST 大腸埃希菌標準菌株。
4．21 抗 LT 抗毒素。
4．22 多粘菌素 B 紙片：300IU，φ16 mm。
4．23 0.1%硫柳汞溶液。
4．24 2%伊文思藍溶液。
5 檢驗程序
致瀉大腸埃希菌檢驗程序如下：
6 操作步驟
6．1 增菌
樣品采集後應盡快檢驗。 除了易腐食品在檢驗之前應預冷藏外， 一般不冷藏。
以無菌手續稱取檢驗25 g，加在225 mL營養肉湯中，以均質器打碎1 min或用
乳缽加滅菌砂磨碎。取出適量，接種乳糖膽鹽培養基，以測定大腸菌群MPN，其
餘的移入500 mL廣口瓶內，於36±1℃培養6 h。挑取1 環，接種於 1管30 mL
腸道菌增菌肉湯內，於 42℃培養 18 h。
6．2 分離
將乳糖發酵陽性的乳糖膽鹽發酵管和增菌液分別劃線接種麥康凱或伊紅美
藍瓊脂平板；汙染嚴重的檢樣，可將檢樣勻液直接劃線接種麥康凱或伊紅美藍平
板，於36±1℃培養18～24 h，觀察菌落。不但要注意乳糖發酵的菌落，同時也
要注意乳糖不發酵和遲緩發酵的菌落。
6．3 生化試驗
6．3．1 自鑒別平板上直接挑取數個菌落分別接種三糖鐵瓊脂（TSI）或克氏雙
糖鐵瓊脂（KI）。同時將這些培養物分別接種蛋白腖水、半固體、pH7.2 尿素瓊
脂、KCN 肉湯和賴氨酸脫羧酶試驗培養基。以上培養物均在 36℃培養過液。
6．3．2 TSI 斜麵產酸或不產酸，底層產酸，H2S陰性和尿素陰性的培養物為大
腸埃希氏菌。TSI底層不產酸，或H2S、KCN、尿素有任一項為陽性的培養物，均
非大腸埃希氏菌。必要時做氧化酶試驗和革蘭氏染色。
6．4 血清學試驗
6．4．1 假定試驗：挑取經生化試驗證實為大腸埃希菌的瓊脂培養物，用致病
性大腸埃希氏菌、 侵襲性大腸埃希氏菌和產腸毒素大腸埃希氏菌多價O 血清和出
血性大腸埃希氏菌 O157 血清做玻片凝集試驗。當與某一種多價 O 血清凝集時，
再與該多價血清所包含的單價O血清做試驗。 致瀉大腸埃希氏菌所包括的 O抗原
群見表 1。如與某一單價 O 血清呈現強凝集反應，即為假定試驗陽性。
表 1 致瀉大腸埃希氏菌所包括的 O 抗原群
大腸埃希氏菌的種類 所包括的 O 抗原群
EPEC
O26 O55 O86 O111ab O114 O119 O125ac O127
O128ab O142 O158
EHEC O157
EIEC
O28ac O29 O112ac O115 O124 O135 O136 O143
O144 O152 O164 O167
ETEC
O6 O6 O11 O15 O20 O25 O27 O63 O78 O85
O114 O115 O26 O128ac O148 O149 O159 O166
O167
6．4．2 證實試驗：製備 O 抗原懸液，稀釋至與 Mac Farland3 號比濁管相當的
濃度。原效價為 1：160～1：320 的 O 血清，用 0.5%鹽水稀釋至 1：40。稀釋血
清與抗原懸液在 10 mm×75 mm 試管內等量混合，做單管凝集試驗。混勻後放於
50℃水浴箱內，經 16 h 後觀察結果。如出現凝集，可證實為該 O 抗原。
6．5 腸毒素試驗
6．5．1 酶聯免疫吸附試驗檢測 LT 和 ST。
6． 5．1． 1 產毒培養： 將試驗菌株和陽性及陰性對照菌株分別接種於 0.6 mLCAYE
培養基內，37℃振蕩培養過夜。加入 20000IU/mL 的多粘菌素 B0.05 mL，於 37
℃1 h，離心 4000 r/min15 min，分離上清液，加入 0.1%硫柳汞 0.05 mL，於 4℃保存待用。
6．5．1．2 LT檢測方法（雙抗體夾心法） ： （1）包被：先在產腸毒素大腸埃希
氏菌 LT和ST 酶標診斷試劑盒中取出包被用LT抗體管，加入包被液 0.5 mL，混
勻後全部吸出於 3.6 mL 包被液中混勻，以每孔 100 uL 量加入到 40 孔聚苯乙烯
硬反應板中，第一孔留空作對照，於4℃冰箱濕盒中過夜。 （2）洗板：將板中溶
液甩去，用洗滌液I洗3次，甩盡液體，翻轉反應板，在吸水紙上拍打，去盡孔
中殘留液體。 （3）封閉：每孔加100 uL封閉液，於37℃水浴中1 h。 （4）洗板：
用洗滌液Ⅱ洗3 次，操作同上。 （5）加樣本：每也分別加各種試驗菌株產毒培養
液100 uL，37℃水浴中1 h。（6）洗板：用洗滌Ⅱ洗3次，操作同上。 （7）加酶
標抗體：先在酶標 LT 抗體管中加 0.5 mL 稀釋液，混勻後全部吸出於 3.6 mL 稀
釋液中混勻，每孔加100 uL，37℃水浴中1 h。 （8）洗板：用洗滌液Ⅱ洗3次，
操作同上。 （9）酶底物反應：每孔（包括第一孔）各加基質液 100 uL，室溫下
避光作用5～10 min，加入終止液50 uL。 （10）結果判定：以酶標儀在波長492
nm 下測定光度 OD 值，待測標本 OD 值大於陰性對照 3 倍以上為陽性，目測顏色
為桔黃色或明顯高於陰性對照為陽性。
6．5．1．3 ST 檢測方法（抗原競爭法） ： （1）包被：先在包被用 ST 抗原管中
加0.5 mL包被液，混勻後全部吸出於 1.6 mL包被液中混勻，以每孔50 uL加入
於 40 孔聚苯乙烯軟反應板中。加液後輕輕高敲板，使深布滿孔底。第一孔留空
作對照， 置4℃冰箱濕盒中過夜。 （2） 洗板： 用洗滌液I 洗 3 次， 操作同一。 （3）
封閉：每孔加 100 uL 封閉液，37℃水浴 1 h。 （4）洗板：用洗滌Ⅱ洗 3 次，操
作同上。 （5） 加樣本及ST 單克降抗體： 每孔分別加各試驗菌株產毒培養液50 uL，
稀釋的 ST 單克隆抗體 50 uL（先在 ST 單克隆抗體管中加 0.5 mL 稀釋液，混勻
後全部吸出於1.6 mL稀釋液中，混勻備用） ，37℃水浴1 h。96）洗板：用洗滌
液Ⅱ洗3次，操作同上。 （7）加酶標記兔抗鼠Ig複合物：稱在酶標記兔抗鼠Ig
複合物管中加0.5 mL稀釋液，混勻後全部吸出於 3.6 mL稀釋液中混勻，每孔加
100 uL，37℃水浴1 h。 （8）洗板：用洗滌液Ⅱ洗 3次，操作同上。（9）酶底物
反應：每孔（包括第一孔）各加基質液 100 uL，室溫下避光5～10 min，再加入
終止液50 uL。 （10）結果判定：以酶標儀在波長 492 nm 下測定吸光度（OD）值：
×
−
值 陰性對照
值 待測樣本 值 陰性對照
OD
OD OD ≥50%為陽性
目測無色或明顯淡於陰性對照為陽性。
6．5．2 雙向瓊脂擴散試驗檢測 LT：將被檢菌株按五點環形接種於 Elek 氏培
養基上。以同樣操作，共做兩份，於 36℃培養 48 h。在每株菌的菌苔上放多粘
菌素 B 紙片，於 36℃經 5～6 h，使腸毒素滲入瓊脂中，在五點環形菌苔各5 mm
處的中央，按一個直徑 4 mm 的圓孔，並用一滴瓊脂墊底。在平板的中央孔內滴
加 LT 抗毒素 30 uL，用已知產 LT 和不產毒菌株作對照，於 36℃經 15～20 h 觀
察結果。 在菌斑和抗毒素孔之間出現白色沉澱帶者為陽性， 無沉澱帶有者為陰性。
6．5．3 乳鼠罐胃試驗檢測 ST
將被檢菌株接種於Honda氏產毒肉湯內，於 36℃培養 24 h，以 3000 r/min
離心 30 min，取上清液經薄膜濾器過濾，加熱60℃30 min，每1 mL濾液內加入
2%伊文思藍溶液0.02 mL。 將此濾液用塑料小管注入1～4目齡的乳鼠胃內0.1 mL，
同時接種3～4 隻， 禁食3～4 h後用三氯甲烷麻醉， 取出全部腸管， 稱量腸管 （包
括積液）重量及剩餘體得。腸管重量與剩餘體重之比大於 0.09 為陽性，0.07～
0.09 為可疑。
6．6 結果報告
綜合以上生化試驗、血清學試驗、腸毒素試驗作出報告。
附加說明：
本標準由衛生部衛生監督司提出。
本標準由江西省衛生防疫站負責起草。
本標準主要起草人何曉青。
本標準由衛生部委托技術歸口單位衛生部食品衛生監督檢驗所負責解釋。
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