鏈黴菌原生質體的轉化 1. 將最多5 ul的DNA（質粒或酶連產物）加於已經裝有50 ul原生質體的指型管（1.5 ml）的管壁上（不與原生質體接觸）。 2. 吸取200ul的25% PEG4000（PEG應先滅菌，再用P Buffer配置），將DNA衝入原生質體中，小心抽吸幾次使之混勻。 3. 將混合物塗布於R5平板上（不含任何抗生素）。 4. 30度培養14~20 hr後（待原生質體再生後，即平板呈霧狀），用含有適當抗生素的1 ml無菌水溶液覆蓋。 5. 再培養1~2 d後，可以看到小的轉化子菌落長出。 PCR-Targeting技術中E.coli電轉化感受態的製備及電轉化 1. 將天藍色鏈黴菌庫斯質粒轉化進入大腸杆菌BW25113/pIJ790*菌株中，此步可用常規的CaCl2 法。（pIJ790帶有cat基因和對溫度敏感的複製區，培養時溫度要嚴格控製在30゜C以下） 2. 培養含庫斯質粒的BW25113/pIJ790菌株：從平板上挑取大腸杆菌單菌落接入5ml 含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp的SOB-MgSO4 （不加MgCl2 的SOB中加入MgSO4至20mM ）中，30゜C搖床培養過夜。 3. 取一部分過夜培養物至25ml新鮮的SOB-MgSO4 培養基（含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp）中，菌體終濃度為1% ，添加250ul 1M L-阿拉伯糖誘導λ/red 重組係統。 4. 30゜C ，200rpm搖床培養3-5h 至OD600~0.6 。 5. 將培養物倒入預冷的30ml離心管中，冰上置10min(從此細胞溫度要保持在0~4゜C)。4000rpm 4゜C離心 5min。 6. 棄掉上清，加1ml預冷的10%甘油，在冰上打散沉澱，再加9ml 10%甘油,搖勻。 7. 4000rpm 4゜C離心 5min，棄掉上清，用10%甘油洗滌。重複上麵操作：4000rpm 4゜C離心5min，盡量棄去上清，用殘留液將細胞打散。（感受態細胞濃度越高電轉效果越好） 8. 在預冷的0.2cm的電轉化杯中混合50ul感受態細胞與1-2ul PCR產物（經純化，可盡量濃，但不能加得過多），混勻後立即電擊，電擊條件：200Ω,25uF,2.5kv, 電擊結果為4.5~4.9ms 較理想。（電轉化杯在70％乙醇中保存，用前先在無菌環境下用無水乙醇洗一下，再吹幹，放冰上預冷，無水乙醇能加快吹幹的速度。也可以選擇0.1cm的電轉化杯，但電擊的參數就得變為：1.8 kV，？Ω,?uF） 9. 立即加1ml預冷的SOC，37゜C誘導培養40min（如需在同一庫斯質粒上中斷基因，則30゜C誘導培養）。 10. 塗LA（含100ug/ml Amp及與電轉片段攜帶的抗性標記相應的抗生素）平板，37゜C過夜培養。（轉化子中含有兩種質粒，分別是重組前和重組後的質粒，所以要抽質粒再轉化一次DH5）
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