產氣莢膜梭菌檢驗

 1  主題內容與適用範圍 
本標準規定了產氣莢膜梭菌的檢驗方法。 
本標準適用於食品和食物中毒樣品中產氣莢膜梭菌的檢驗。 
2  引用標準 
    GB 4789.28  食品衛生微生物學檢驗  染色法、培養基和試劑 
3  設備和材料 
3．1  均質器。 
3．2  顯微鏡。 
3．3  溫箱：36±1℃。 
3．4  水浴。 
3．5  厭氧培養裝置：常溫催化除氧式或堿性焦性沒石子酸除氧式。 
3．6  吸管：1 mL，10 mL。 
3．8  平皿。 
3．9  接種環或接種針。 
 
4  培養基和試劑 
4．1  庖肉培養基：GB 4789.28 中 4.67。 
4．2  亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（SPS） ：GB 4789.28 中 4.69。 
4．3  液體硫乙醇酸鹽培養基（FT） ：GB 4789.28 中 4.70。 
4．4  動力-硝酸鹽培養基：GB 4789.28 中 4.72。 
4．5  含鐵牛奶培養基：GB 4789.28 中 4.71。 
4．6  卵黃瓊脂培養基：GB 4789.28 中 4.68。 
4．7  0.1%蛋白腖水稀釋劑：GB 4789.28 中 4.86。 
4．8  硝酸鹽還原試劑：GB 4789.28 中 3.17。 
4．9  革蘭氏染色液：GB 4789.28 中 2.2。 
5  檢驗程序 
    產氣莢膜梭菌檢驗程序如下： 
6  操作步驟 
6．1  活菌計數培養 
6．1．1  按無菌操作稱取食品檢樣 25  g（mL）放入均質器，加 0.1%蛋白腖稀釋劑 225 mL，低速攪動 1～2 min，使之均質化，作為 1：10 稀釋液。 
6．1．2  以上述 1： 10稀釋的均質液按 1  mL加0.1%蛋白腖稀釋劑9mL做成10^-2～10^-6的係列稀釋液。 
6．1．3  吸取各稀釋液 1 mL 分別放入 2 個滅菌平皿內。每個平皿澆注約 50℃的 SPS 瓊脂 15～20 mL，仔細轉動平皿，使稀釋液和瓊脂充分混勻。 
6．1．4  上述瓊脂平板凝固後，倒置於厭氧培養裝置內，於 36±1℃培養 24  h。  
6．1．5  選取長有 30～300 個黑色菌落的平板，計數黑色菌落數。 
6．2  確證試驗 
6．2．1  由平板上任取 10 個黑色菌落，分別按種 FT 培養基，於 36±1℃培養18～24 h。 
6．2．2  用上述培養液塗片，革蘭氏染色鏡檢。產氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性粗大杆菌，其耐熱株可能形成卵形芽孢，位於菌體中央或近端，其寬度一般不大於菌體。 
6．2．3  用接咱環（針）穿刺接種動力-硝酸鹽培養基，於 36±1℃培養 24 h，觀察接種線的生長情況，判斷有無動力。然後，滴加甲萘胺液和對氨基苯碘酸液各 0.5 mL，觀察硝酸鹽是否被還原。產氣莢膜梭菌無動力，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。 
6．2．4  取生長旺盛的 FT 培養液 1  mL 接種於含鐵牛乳培養基，在 46℃水浴中培養 2 h後觀察有無“暴烈發酵”現象，5 h 內發酵者為陰性。產氣莢膜梭菌發酵乳糖，凝固酪蛋白並大量產氣，呈“暴烈發酵”現象，但培養基不變黑。 
6．2．5  用接種環取 FT 培養液點種於卵黃瓊脂平板（每張平板至少可接種 10點） ，於 36±1℃厭氧培養 24 h，觀察接種點的變化。產氣莢膜梭菌產生卵磷脂酶，分解卵黃中的卵磷脂，接種點的底部及周圍形成乳白色的混濁帶。 
6．3  菌數計算 
根據黑色菌落的計數（6.1.5）和確證試驗的結果（6.2） ，計算每克（毫升）食品檢樣的含菌數。 例如：10^-4稀釋液的平板長有黑色菌落 100 個，而供做確證試驗的 10 個菌落中有 7 個被確證為產氣莢膜梭菌，則每克（毫升）食品檢樣所含產氣莢膜梭菌數為： 100×0.7×10⁴=7×10⁵
附加說明： 
本標準由衛生部衛生監督司提出。 
本標準由衛生部蘭州生物製品研究所負責起草。 
本標準主要起草人王成懷。 
本標準由衛生部委托技術歸口單位衛生部食品衛生監督檢驗所負責解釋。   
   

 

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