（1） 在外層鍋內加適量的水，將需要滅菌的物品放入內層鍋，蓋好鍋蓋並對稱地扭緊螺旋。
（2） 加熱使鍋內產生蒸氣，當壓力表指針達到 33.78kPa時，打開排氣閥，將冷空氣排出，此時壓力表指針下降，當指針下降至零時，即將排氣閥關好。
（3） 繼續加熱，鍋內蒸氣增加，壓力表指針又上升，當鍋內壓力增加到所需壓力時，將火力減小，按所滅菌物品的特點，使蒸氣壓力維持所需壓力一定時間，然後將滅菌器斷電或斷火，讓其自然冷後再慢慢打開排氣閥以排除餘氣，然後才能開蓋取物。
2．注意事項：
（1） 待滅菌的物品放置不宜過緊。
（2） 必須將冷空氣充分排除，否則鍋內溫度達不到規定溫度，影響滅菌效果。
（3） 滅菌完畢後，不可放氣減壓，否則瓶內液體會劇烈沸騰，衝掉瓶塞而外溢甚至導致容器爆裂。須待滅菌器內壓力降至與大氣壓相等後才可開蓋。
（4） 裝培養基的試管或瓶子的棉塞上，應包油紙或牛皮紙，以防冷凝水入內。
（5） 為了確保滅菌效果，應定期檢查滅菌效果，常用的方法是將硫磺粉末（熔點為115℃）或安息香酸（熔點為120℃）置於試管內，然後進行滅菌試驗。如上述物質熔化，則說明高壓蒸氣滅菌器內的溫度已達要求，滅菌的效果是可靠的。也可將檢測滅菌器效果的膠紙（其上有溫度敏感指示劑）貼於待滅菌的物品外包裝上，如膠紙上指示劑變色，亦說明滅菌效果是可靠的。
（6） 現在已有微電腦自動控製的高壓蒸氣滅菌器，隻需放去冷氣後，儀器即可自動恒壓定時，時間一到則自動切斷電源並鳴笛，使用起來很方便。
3．應用：為最常用的滅菌方法，一般以 101.33kPa處理15～20min，可達到對物品進行滅菌的目的。凡耐高溫和潮濕的物品，如常用培養基、生理鹽水、衣服、紗布、玻璃器材等都可用本法滅菌。
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