副溶血性弧菌的致病因子

    研究表明 ,副溶血性弧菌的致病因子主要有溶血素、脲酶 ;其他與致病有關的致病因子也在研究中。

    1. 溶血素  副溶血性弧菌主要致病作用在於它可以產生多種溶血素 ,它們是耐熱直接溶血素(thermostabledirecthemolysin,TDH )、耐熱直接溶血素相關溶血素(TDH2relatedhemolysin,TRH )和不耐熱溶血素(thermolabilehemolysin,TLH)。

    流行病學研究表明 ,臨床上分離出的副溶血性弧菌幾乎95%以上都會使特殊的我萋血瓊脂培養基產生β溶血 , 被稱為神奈川現 象(kangawa phenomenon,KP) 。Obara(1971) 從 KP 陽性的細菌培養濾液中分離到耐熱性溶血素 ,該毒素是不含糖或脂質的蛋白質 ,由2 個相同的亞單位組成 ,由 165 個氨基酸殘基組成 ,相對分子質量(Mr) 為 42 ×10³ ,此種溶血素在100 ℃、10min仍保持活性 ,並在加入卵磷脂後不能增強其溶血活性 ,表明是直接作用於紅細胞 ,故稱為 TDH。TDH 由tdh基因編碼 ,TDH陽性株含有 2 個 tdh 基因 ,即 tdh1 和 tdh2。tdh1 和 tdh2編碼的 TDH僅有7 個氨基酸不同 ,典型的 KP⁺分離株的2 種基因拷貝有97.2%同源 ,其溶血活性相同 ,抗原性有交叉 ,不能區分 ,經 Edman 降解法得到的蛋白質序列比較發現 KP⁺ 株 tdh2 具有表達優勢。

    Nishibuchi 等 從馬爾代夫旅遊腹瀉患者排泄物中分離到1 批 KP^-的副溶血性弧菌 ,表明副溶血性弧菌除溶血素 TDH外 ,還有其他致病因子 ,從這些細菌培養濾液中分離到另外 1 種溶血素 ,它可以引起紅細胞溶血 ,但不耐熱 ,且引起溶血的敏感動物紅細胞的種類與 TDH不同(對牛紅細胞的溶血活性很高 ,對馬紅細胞無溶血活性),現命名為 TRH。1O%～15%臨床分離株產生 TRH,這些分離株一般TDH陰性 ,TRH 在 60 ℃以上 10min 即可滅活 ,其Mr 為48 ×10³ ,是由2 個 Mr 各為 23 ×10³ 的亞單位組成 ,TRH與 TDH的氨基酸序列有 7O%同源 ,編碼這2 種毒素的基因 trh 和 tdh 的同源性為 68.1%,

    TRH與 TDH的抗原性有部分交叉 ,兩者免疫原性相似。trh基因據其核酸序列的變化又可分為 2 個亞組:trhl 和 trh2 基因 ,兩者同源性為 84%,分別編碼蛋白 TRH1 和 TRH2。Kishishita 等 研究認為 ,trhl和trh2 序列的不同會影響其蛋白質的特性 ,trhl 的基因產物對人、鼠、羊和牛的紅細胞均有溶血作用 ,而trh2 基因產物隻對人和兔的紅細胞有溶血活性且溶血活性相對較弱。

    TDH和 TRH具有直接溶血活性 ,可使多種紅細胞發生溶血 ,溶血過程可以分為 2 步:首先 ,溶血素與宿主的紅細胞膜結合 ,此過程呈溫度依賴性並由受體介導 ,主要是神經節苷脂-2 (GM2),GM1 也參與信號介導;而後 ,在紅細胞膜表麵成孔並最終導致紅細胞膠樣滲透溶解 ,此過程也呈溫度依賴性。兔、狗、豚鼠和人類的紅細胞對 TDH較敏感。TDH還具有腸毒素活性和細胞毒活性 ,在兔動物模型中可導致腸液積聚和腸道氯化物的外排。TDH 還引起人類腹瀉 ,其致病機製主要是 ,TDH 被認為是一種孔蛋白 ,可使細胞膜上形成小孔通道 ,引起細胞外Ca²⁺ 濃度增加 ,從而引起Ca²⁺ 激活的Cl^-通道開放 ,Cl^- 分泌增加。當 TDH引起的這種細胞滲透壓的改變超過細胞的代償調節能力 ,將使細胞發生病理和形態學改變 ,導致細胞膨脹甚至死亡。TDH還具有心髒毒性和致死作用。

    近年來的研究發現 ,副溶血性弧菌除了產生TDH和 TRH溶血素外 ,還可產生另 1 種溶血素 ,即TLH。Hatsumit 等 於1985 年研究發現無論是臨床

    分離株還是環境分離株都含有tlh基因 ,並具有種的特異性 ,生化試驗表明 TLH 是一種非典型的磷脂酶 ,需要卵磷脂的存在才具有溶血活性 ,但其功能和致病性仍不十分清楚。TLH由tlh基因編碼 ,國外已報道了編碼 TLH的基因序列 ,tlh 位於染色體上 ,長約1.3kb。李誌峰等 對 tlh 基因進行克隆和序列分析 ,顯示 TLH 作為特異性診斷靶抗原 ,具有潛在的應用價值。

    2. 脲酶  大量研究發現 ,脲酶(Ure)與副溶血性弧菌的致病性存在一定關係。Iida 等 通過基因組分析發現 ,Ure 由Ure 基因簇編碼 ,Ure⁺菌與 TRH之間呈正相關性。Ure 和 trh 基因都位於小的複製子上 ,且兩者的基因序列位於染色體DNA 相鄰的編碼區 ,利用長距和精確聚合酶鏈反應(PCR)測得 ure 和trh基因之間的距離小於 8.5kb。研究還表明 ,在尿素缺乏時 ,副溶血性弧菌Ure 的表達活性極低 ,隻達1%,當有尿素作為介質時 ,其活性可提高 100 倍。綜合以上因素 ,很多學者認為 Ure 可以作為快速檢測副溶血性弧菌 ,尤其是 KP^- 菌的一個生物學標誌。Okuda 等 對 1979～1995 年從美國西海岸分離的Ure⁺ 和 Ure^- 副溶血弧菌進行檢測 ,結果表明60 株為 Ure⁺ 株 ,59 株(98%) 攜帶 trh (trhl 和/或trh2) ,54 株(90%) 攜帶 tdh;25 株為 Ure^-株 ,20 株 (80%) 攜帶tdh,但無1 株攜帶trh基因。

    3. 其他致病因子  通過兔腸絨毛上皮黏附試驗 ,對副溶血性弧菌的黏附機製進行研究 ,證明菌毛與該菌的黏附作用有關 。很多實驗證實副溶血性弧菌具有侵襲力 ,並且證實侵襲力是其毒力的一部分。Akeda 等 通過藥敏試驗 ,發現副溶血性弧菌對 Caco22 細胞產生侵襲作用 ,而細胞鬆弛素D、諾考達唑能阻斷副溶血性弧菌 AQ4023 對 Caco22 細胞的侵襲力 ,這也表明酪氨酸蛋白激酶介導的信號轉導、鞭毛和細胞骨架可能在侵襲過程中發揮一定作用。Wang等 發現甲基轉移酶基因位於副溶血性弧菌的22.79kb致病島 ,它的存在與弧菌的毒力因子的相關性超過98%。

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