實驗目的
1．學習並初步掌握革蘭氏染色法。
2．了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。
實驗內容
1．製作細菌染色裝片。
2．分別對單菌和混菌進行革蘭氏染色法操作。
實驗原理
用於生物染色的染料主要有堿性染料、 酸性染料和中性染料三大類。 堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低，當它生長於中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常采用堿性染料（如美藍、結晶紫、堿性複紅或孔雀綠等）使其著色。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養基 pH下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性複紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱複合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。
革蘭氏染色法是 1884年由丹麥病理學家 C.Gram所創立的。 革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類，是細菌學上最常用的鑒別染色法。
該染色法所以能將細菌分為 G+菌和 G—菌，是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G—菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的複合物易於滲出，結果細菌就被脫色， 再經蕃紅複染後就成紅色。G+ 菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高， 類脂質含量少，經脫色劑處理後反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。
實驗器材
培養 12-16h的枯草杆菌（Bacillus subtilis），培養 24 小時的大腸杆菌（Escherichia coli）
結晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅、液體石蠟、擦鏡液
載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。
實驗步驟
一、單菌的革蘭氏染色：
分別取枯草杆菌、大腸杆菌進行革蘭氏染色。
1．製片：
(1) 塗菌：取幹淨載玻片一塊，在載玻片上加一滴生理鹽水，按無菌操作法取菌塗片，注意取菌不要太多。
(2) 幹燥：讓塗片自然晾幹或者在酒精燈火焰上方文火烘幹。
(3)固定：手執玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰 2-3次固定（以不燙手為宜）
2．染色
(1) 初染：滴加結晶紫（以剛好將菌膜覆蓋為宜）染色 1～2min，水洗。
(2) 媒染：用碘液衝去殘水，並用碘液覆蓋約 1min，水洗。
(3) 脫色：用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加 95％的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗。
(4) 複染：用番紅液複染約 2min，水洗。
3．鏡檢：幹燥後，用油鏡觀察。菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌，被染成紅色的為革蘭氏陰性菌。
二、混菌的革蘭氏染色：
按上述方法，在同一載玻片上，以大腸杆菌和枯草芽孢杆菌作混和塗片、染色、鏡檢進行比較。
實驗結果及討論
1．實驗結果
列表簡述 2株細菌的染色觀察結果（說明各菌的形狀、顏色和革蘭氏染色反應），分別繪製單菌及混菌的染色結果。
2．討論
針對實驗原理、步驟、現象進行討論。
實驗作業
1．你認為哪些環節會影響革蘭氏染色結果的正確性？其中最關鍵的環節是什麽？
2．進行革蘭氏染色時，為什麽特別強調菌齡不能太老，用老齡細菌染色會出現什麽問題？
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