實驗目的
掌握細菌的鞭毛染色技術。
實驗內容
學習細菌的鞭毛染色法。
實驗原理
細菌的鞭毛極細，直徑一般為 10—20nm，隻有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，則在普通光學顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然後再進行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配製而成。現推薦以下兩種染色法。
實驗器材
培養 12-16h的水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae），粘質賽氏杆菌（Serratia marcescens）或假單細胞菌（Pseudomonas sp.）斜麵菌種。
銀染色液、Leifson染色液、香柏油、二甲苯。
載玻片、擦鏡紙、吸水紙、記號筆、玻片擱架、鑷子、接種環，顯微鏡。
實驗步驟
1．鍍銀法染色
(1) 清洗玻片 選擇光滑無裂痕的玻片，最好選用新的。為了避免玻片相互重疊，應將玻片插在專用金屬架上， 然後將玻片置洗衣粉過濾液中 （洗衣粉煮沸後用濾紙過濾， 以除去粗顆粒）， 煮沸 20min。
取出稍冷後用自來水衝洗、晾幹，再放入濃洗液中浸泡 5—6天，使用前取出玻片，用自來水衝去殘酸，再用蒸餾水洗。將水瀝幹後，放入 95%乙醇中脫水。
(2) 菌液的製備及製片：菌齡較老的細菌容易失落鞭毛，所以在染色前應將待染細菌在新配製的牛肉膏蛋白腖培養基斜麵上（培養基表麵濕潤，斜麵基部含有冷凝水）連續移接 3-5 代，以增強細菌的運動力。最後一代菌種放恒溫箱中培養 12—16h。然後，用接種環挑取斜麵與冷凝水交接處的菌液數環，移至盛有 1—2mL無菌水的試管中，使菌液呈輕度混濁。將該試管放在 37℃恒溫箱中靜置10min （放置時間不宜太長，否則鞭毛會脫落），讓幼齡菌的鞭毛鬆展開。然後，吸取少量菌液滴在潔淨玻片的一端，立即將玻片傾斜，使菌液緩慢地流向另一端，用吸水紙吸去多餘的菌液。塗片放空氣中自然幹燥。
用於鞭毛染色的菌體也可用半固體培養基培養。方法是將 0.3-0.4%的瓊脂肉膏培養基熔化後倒入無菌平皿中，待凝固後在平板中央點接活化了 3-4代的細菌，恒溫培養 12-16h後，取擴散菌落的邊緣製作塗片。
(3) 染色
① 滴加 A液，染 4—6min。
② 用蒸餾水充分洗淨 A液。
③ 用 B 液衝去殘水，再加 B 液於玻片上，在酒精燈火焰上加熱至冒氣，約維持 0.5—1min（加熱時應隨時補充蒸發掉的染料，不可使玻片出現幹涸區）。
④ 用蒸餾水洗，自然幹燥。
(4) 鏡檢：先低倍，再高倍，最後用油鏡檢查。
結果：菌體呈深褐色，鞭毛呈淺褐色。
2．改良 Leifson染色法
(1) 清洗玻片法同 1。
(2) 配製染料 染料配好後要過濾 15-20次後染色效果才好。
(3) 菌液的製備及塗片
① 菌液的製備同 1。
② 用記號筆在潔淨的玻片上劃分 3—4個相等的區域。
③ 放 1滴菌液於第一個小區的一端，將玻片傾斜，讓菌液流向另一端，並用濾紙吸去多餘的菌液。
④ 幹燥 在空氣中自然幹燥。
(4) 染色
① 加染色液於第一區，使染料覆蓋塗片。隔數分鍾後再將染料加入第二區，依此類推 （相隔時間可自行決定），其目的是確定最合適的染色時間，而且節約材料。
② 水洗：在沒有傾去染料的情況下，就用蒸餾水輕輕地衝去染料，否則會增加背景的沉澱。
③ 幹燥：自然幹燥。
(5) 鏡檢 先低倍觀察，再高倍觀察，最後再用油鏡觀察，觀察時要多找一些視野，不要企圖在 1-2個視野中就能看到細菌的鞭毛。
結果：菌體和鞭毛均染成紅色。
注意事項
1．鍍銀法染色比較容易掌握，但染色液必須每次現配現用，不能存放，比較麻煩。
2．Leifson染色法受菌種、菌齡和室溫等因素的影響，且染色液須經 15-20次過濾，要掌握好染色條件必須經過一些摸索。
3．細菌鞭毛極細，很易脫落，在整個操作過程中，必須仔細小心，以防鞭毛脫落。
4．染色用玻片幹淨無油汙是鞭毛染色成功的先決條件。
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