下麵以MS培養為例,其成分可以分為水、無機鹽、有機物、天然複合物、培養體的支持材料等五大類。
1.水
作用:原生質體的組成成分,代謝過程的介質和溶媒。它是生命活動過程中。配製:培養基母液時要用蒸餾水:配培養基時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水。
2.無機元素
大量元素,指濃度大於0.5mmol/l的元素,有N、P、K、Ca、Mg、S等。其作用是:
(1)N
功能:是蛋白質、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分,是生命結構和功能物質不可缺少的。
供應形式:含有NO3-N又含NH4-N。NH4-N對植物生長較為有利。在製備培養基時以這兩種形式供應。供應的物質有KNO3、、NH4NO3等。有時,也添加氨基酸。
(2)P
功能:是磷脂的主要成分,而磷脂又是細胞膜、細胞核的重要組成部分。磷也是核酸、ATP、輔酶等的組成成分。組織培養中,磷不僅增加養分、提供能量,而且也促進對N的吸收,增加蛋白質在植物體中的積累。
供應形式:常用的物質有KH2PO4或NaH2PO4等。
(3)K
功能:K對碳水化合物合成、轉移、以及氮素代謝等有密切關係,它具有活化酶的作用。K增加時,蛋白質合成增加,維管束、纖維組織發達,對胚的分化有促進作用。但濃度不易過大,一般為1~3mg/l為好。
供應形式:製備培養基時,常以KCl、KNO3 等鹽類提供。
(4) Mg、S和Ca
功能: Mg是葉綠素的組成成分,又是激酶的活化劑;S是含硫氨基酸所構成蛋白質的組成成分。Ca 是構成細胞壁的一種成分,Ca對細胞分裂、保護質膜不受破壞有顯著作用,
供應形式:以MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O提供。
(5)微量元素
種類:指小於0.5mmol/l的元素, Fe、B、Mn、Cu、Mo、Co等。
功能:鐵是一些氧化酶、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶等的組成成分。同時,它又是葉綠素形成的必要條件。培養基中的鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉綠有促進作用。B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co等,也是植物組織培養中不可缺少的元素,缺少這些物質會導致生長,發育異常現象。
供應形式:因其在pH5.2以上,易形成Fe(OH)3的不溶性沉澱,故用Fe SO4·7H2O和 Na2-EDTA結合成螯合物使用。
當某些營養元素供應不足時,愈傷組織表現出一定的缺素症狀。如缺氮,會表現出一種花色素苷的顏色,不能形成導管;缺鐵,細胞停止分裂;缺硫,表現出非常明顯的褪綠;缺錳或鉬,則影響細胞的伸長。
3.有機化合物
(1)碳水化合物
供應形式:最常用蔗糖,葡萄糖和果糖也較好,麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖也有應用。
使用濃度:2~3%,常用3%,即配製1升培養基稱取30g蔗糖,有時可用2.5%,但在胚培養時采用4~15%的高濃度,因蔗糖對胚狀體的發育起重要作用。
用量注意:不同糖類對生長的影響不同。以葡萄糖效果最好,果糖和蔗糖相當,麥芽糖差一些;不同植物不同組織的糖類需要量也不同,
代用品:在大規模生產時,可用食用的綿白糖代替。
(2)維生素
種類:主要有VB1 (鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、VPP(煙酸)、VC(抗壞血酸) 、有時還使用生物素、葉酸、VB2等。一般用量為0.1~1.0mg/l。有時用量較高。
功能:以各種輔酶的形式參與多種代謝活動,促進生長、分化作用。VB1對愈傷組織的產生和生活力有重要作用,VB6能促進根的生長,VPP與植物代謝和胚的發育有一定關係。VC有防止組織變褐的作用。
(3)肌醇 又叫環己六醇,
功能:參與構建細胞壁。由磷酸葡萄糖轉化而來,進一步生成果膠物質。
肌醇與6分子磷酸殘基相結合形成植酸,植酸與鈣、鎂等陽離子結合成植酸鈣鎂,植酸可進一步形成磷脂,參與細胞膜的構建。
能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。促進組織和細胞的繁殖、分化。
使用濃度:一般為100mg/l,
(4)氨基酸
功能:作為有機氮源,利於被細胞直接吸收利用。
常用種類:甘氨酸,其它如精氨酸、穀氨酸、穀酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。
特殊應用:用水解乳蛋白或水解酪蛋白,是牛乳用酶法等加工的水解產物,含有約二十種氨基酸的混合物,使用注意用量在10~1000mg/l之間。否則極易引起汙染。
(5)天然複合物 大多含氨基酸、激素、酶等一些複雜化合物。它對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用,但對器官的分化作用不明顯。
①椰乳 是椰乳的液體胚乳。它是使用最多、效果最大的一種天然複合物。一般使用濃度在10~20%。
功能:它在愈傷組織和細胞培養中有促進作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養中起明顯的促進作用,但莖尖組織的大小若超過1mm時,椰乳就不發生作用。
其它②香蕉③馬鈴薯④水解酪蛋白⑤酵母提取液(YE)(0.01~0.05%),
4.植物激素 是培養基的關鍵物質,對植物組織培養起著決定性作用。
(1)生長素類
功能:1誘導愈傷組織形成,2誘導根的分化 3促進細胞分裂、伸長生長。在促進生長方麵,根對生長素最敏感。在極低的濃度下,(10-5~10-8mg/L)就可促進生長,其次是莖和芽。
性質:天然的生長素熱穩定性差,高溫高壓或受光條件易被破壞。在體內易受酶解。故常用人工生長素類物質。
配製方法:用少量95%酒精助溶。2,4-D可用0.1mol/l的NaOH或KOH助溶。配後貯於冰箱中。
IAA(indo acetic acid吲哚乙酸)
來源:天然存在的生長素,亦可人工合成,
性質:是活力最弱的激素,對器官形成的副作用小,高溫高壓易被破壞,也易被胞中的IAA分解酶和光照降解。
NAA(naphthalene acetic acid萘乙酸)
來源:來自大批量人工合成,
性質:在組織培養中的起動能力要比IAA高出3~4倍, 耐高溫高壓,不易被分解破壞,所以應用較普遍。
作用:NAA和IBA廣泛用於生根,並與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長。
IBA(indolebutyric acid吲哚丁酸)
來源:人工合成
作用:促進發根能力最強。
2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)
起動能力比IAA高10倍,
功能:特別在促進愈傷組織的形成上活力最高,但它強烈抑製芽的形成,影響器官的發育。適宜的用量範圍較狹窄,過量常有毒效應。
(2)GA(gibberellic acid赤黴素) 有20多種,培養基中常添加是GA3生理活性及作用的種類、部位、效應等各有不同,
作用:1促進幼苗莖的伸長生長,2赤黴素還用於打破休眠,促進種子、塊莖、鱗莖等提前萌發。3添加赤黴素可促進器官或胚狀體的生長。
配製:可用少量95%酒精助溶。赤黴素不耐熱,高壓滅菌後將有70~100%失效,應當采用過濾滅菌法加入。
(3)細胞分裂素類
性質和種類:是腺嘌呤的衍生物,包括6-BA(6-苄基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激動素)、Zt(zeatin玉米素)等。
其中ZT活性最強,但非常昂貴,常用的是6-BA。
作用:①誘導芽的分化促進側芽萌發生長,②促進細胞分裂與擴大。③抑製根的分化。因此,多用於誘導不定芽的分化、莖、苗的增殖,避免在生根應用。
生長素與細胞分裂素的比例決定著發育的方向,
生長調節物質的使用甚微,一般生長素濃度的使用為0.05~5mg/l, 細胞分裂素0.05~10mg/L。
5.培養材料的支持物
(1) 瓊脂
功能:隻是固化劑。本身並不提供任何營養。
性質:瓊脂能溶解在熱水90℃以上中,成為溶膠,冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。
用量:在6~10g/l之間,若濃度太高,培養基就會變得很硬,營養物質難以擴散到培養的組織中去。若濃度過低,凝固性不好
質量:一般瓊脂以顏色淺、透明度好、潔淨的為上品。
凝固能力:除與原料、廠家的加工方式有關外,還與高壓滅菌時的溫度、時間、pH值等因素有關,長時間的高溫會使凝固能力下降,過酸過堿加之高溫會使瓊脂發生水解,喪失凝固能力。時間過久,瓊脂變褐,也會逐漸喪失凝固能力。
固體培養基優缺點:操作簡便,通氣問題易於解決,便於觀察研究等,但培養物與培養基的接觸麵小,各種養分擴散較慢,
(2)其它 有玻璃纖維、濾紙橋、海綿等,總的要求是排出的有害物質對培養材料沒有影響或影響較小。
6.抗生物質antibiotic
種類:抗生物質有青黴素、鏈黴素、慶大黴素等,用量在5~20mg/l之間。
作用:防止菌類汙染,
7. 抗氧化物
種類半胱氨酸及Vc,常用50~200mg/l的濃度,其它抗氧化劑有二硫蘇糖醇、穀胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯等。
原理:植物組織在切割時會溢泌一些酚類物質,接觸空氣中的氧氣後,自動氧化或由酶類催化氧化為相應的醌類,產生可見的茶色、褐色以致黑色,這就是酚汙染。這些物質滲出細胞外就造成自身中毒,使培養的材料生長停頓,失去分化能力,最終變褐死亡。木本植物較嚴重,
8. 活性炭active carbon
性質:活性炭為木炭粉碎經加工形成的粉沫結構,它結構疏鬆,孔隙大,吸水力強,有很強的吸附作用
使用濃度:通常使用濃度為0.5-10g/l。
作用:1吸附非極性物質和色素等大分子物質,包括瓊脂中所含的雜質,培養物分泌的酚、醌類物質以及蔗糖在高壓消毒時產生的5-羥甲基糖醛及激素等。
莖尖初代培養,新梢增殖階段,活性炭有效,
2 促進生根
其機理一般認為與活性炭減弱光照有關,可能是由於根頂端產生促進根生長的IAA,但IAA易受可見光的光氧化而破壞,
副作用:研究表示,每毫克的活性炭能吸附100毫微克左右的生長調節物質。
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