克雷伯氏菌ZD112氯氰菊酯降解酶基因的克隆與生物信息學分析

【摘要】  目的 篩選新的菊酯農藥降解酶基因並了解其特性，為解決食品和環境中的菊酯農藥殘留問題創造條件。方法 通過構建基因文庫的方式篩選獲得新的菊酯農藥降解酶 (EstP) 基因，並對其進行一係列生物信息學分析。結果 獲得了新的菊酯農藥降解酶 (EstP) 基因。EstP 屬於水解酶類，由 638 個氨基酸編碼，預測分子量為 73.4 kDa，pI 值為 8.34，與其他蛋白相似性極低，不屬於任何已知的蛋白超家族，僅與羧肽酶Taq (M32) 的保守域具有一定相似性，推測 Lys137, Glu116, Glu148 為其必需氨基酸。 結論 新的菊酯農藥降解基因得到克隆，生物信息學分析為其定向進化提供了理論指導，為高效基因工程菌的構建打下了基礎。

【關鍵詞】  菊酯農藥降解酶；基因克隆；菊酯農藥；生物信息學分析

　　擬除蟲菊酯為第三代殺蟲劑，其長期廣泛的使用，對土壤、大氣和水源等造成了不同程度的汙染［1］ 。其對健康的危害也不容忽視，主要包括對免疫係統的脅迫，對淋巴結和脾髒的損傷、致癌以及環境激素效應等［2］ 。尋找一種有效方法消除或降低食品和環境中的菊酯農藥殘留已成為當前迫切需要解決的問題。
    　　
　　在過去的研究工作中，本實驗室獲得了一株能以菊酯為唯一碳源和氮源生長的伯雷克氏菌株Klebsiella sp. ZD112，鑒於直接應用農藥降解酶製劑比應用產酶的菌劑更有優勢［3］，為了能夠產業化生產菊酯農藥降解酶，通過構建基因文庫的方式獲得了新的菊酯農藥降解酶基因，並進行了一係列生物信息學分析，為高效基因工程菌的構建打下基礎。

　　1  材料與方法

　　1.1  培養基
    　　
　　LB培養基與LA培養基按照分子克隆手冊配製。篩選培養基為加入 100 mg/L 氨苄青黴素（ampicillin）和100 μmol/L 5bromo4chloro3indolylcaprylate (Xcaprylate)的 LB培養基（Xcaprylate可被水解酶水解而形成藍色的水解圈［4］）。

　　1.2  菌株
      
　　大腸杆菌DH5α ［supE44, Δ lacU169 (φ80 lacZΔM15), hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi1, relA1］由本實驗室保存，菊酯農藥降解酶生產菌株Klebsiella sp. ZD112 菌株由本實驗室從汙染土壤分離。pUC18質粒購自TaKaRa公司。

　　1.3  酶和試劑
      
　　各種限製性內切酶、DNA marker、XGal、IPTG購自TaKaRa公司,T4連接酶、去磷酸化酶購自MBI公司。其他生物化學試劑均為國產分析純。

　　1.4  基因文庫的構建
      
　　參照分子克隆手冊提取Klebsiella sp.ZD112基因組DNA和pUC18質粒。ZD112基因組DNA經HindⅢ不完全酶切後電泳，按照3 S DNA Gel Purification kit試劑盒說明書割膠回收2～10 kb片斷。pUC18經 HindⅢ酶切後去磷酸化後並電泳，割膠回收。將酶切並回收的DNA片斷與去磷酸化的克隆載體按5∶1的比例16 ℃連接過夜，Ca轉入大腸杆菌DH5α，並塗布LA平板，進行藍白斑篩選。

　　1.5  目標亞克隆的篩選
　挑取白色的轉化子到含酯酶底物(Xcaprylate)的篩選平板上培養過夜，挑取有藍色水解圈形成的轉化子保存並接種於LA液體培養基中振蕩培養。提取質粒酶切驗證，同時破碎菌體提取粗酶液,測定其對氯氰菊酯的降解率。

　　1.6亞克隆測序與分析
       
　　測序由上betway必威西汉姆联亞生物公司完成。對插入片斷通過ORF Finder ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html )尋找讀碼框，並采用BLASTn ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ )進行同源性分析。
  
　　1.7  目的基因生物信息學分析
      
　　分子量和等電點計算采用DNAstar5.0 軟件計算；蛋白保守域查詢采用rpsBlast ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi )，數據庫選擇為 CDD v2.06-11530 PSMMs，鑒於 EstP 與其他蛋白的同源性非常低，E 值選擇時適當放寬，設為 1；酶與非酶分析采用基於蛋白氨基酸序列性質的 ArchaeaFun 1.0 Server (http://genome.cbs.dtu.dk/ services/Archaea Fun)；蛋白超家族分析采用基於隱馬爾科夫 (Hidden Markov Model, HMM) 算法的 Superfamily 1.61 (http://supfam.mrclmb.cam.ac.uk/SUPERFAMILY/) ，參數選擇：example sequence: Amino acid sequence，Scoring options: Local/local model/sequence scoring，Blast Prefilter Pvalue<10e10；蛋白亞細胞定位采用 Loctree 服務器(http://cubic.bioc.columbia.edu/services/loctree/ )；EstP的多序列比對使用 Clustal X 軟件，相似序列由rpsBlast 獲得，蛋白勢能矩陣選擇為 Blosum series。

　　2  結果與分析

　　2.1  基因文庫的構建
                
　　通過藍白斑篩選，共獲得白色克隆約3萬個。ZD112基因組DNA不完全酶切結果見圖1，質粒pUC18的Hind Ⅲ酶切圖見圖2。

　　2.2  目標亞克隆的篩選與鑒定
       
　　挑取1 500個陽性克隆至到含底物（Xcaprylate）篩選培養基。獲得4個能在篩選培養基產生藍色水解圈的單菌落，挑取後加入Amp含量為100 mg/L的 LB液體培養基培養,甘油保存。其粗酶液對氯氰菊酯的降解率見表1，ZD112粗酶液作對照［5］。
       
　　挑選降解率高的陽性克隆子LA5進行酶切（圖3），從圖中可知，L5A 連接上了大約3.6 kb左右的片段,送測序公司測序(圖4) 。

    用NCBI上的工具ORF finder分析LA5的克隆片段,發現其含有2個較大的開放讀碼框(ORF),一個長度為1 914 bp(ORF1，登錄號: AY995176),另外一個長度為756 bp(ORF2，登錄號: AY954696)。其中ORF1僅與2個細菌預測蛋白有一定相似性（hypothetical protein SC171：88%相似；ebA4602：36 %相似），並含有-10,-35以及RBS(ribosomal binding site)序列（圖5），因此該ORF可能是編碼菊酯降解酶 (EstP) 的新基因。表1  各陽性克隆與ZD112的降解率（略）

　　2.3  生物信息學分析結果
    　　
　　EstP由637 個氨基酸組成，經DNAstar5.0計算出其分子量為 73.4 kDa，pI 值為 8.34。蛋白亞細胞定位分析結果顯示，EstP 屬於細胞質內蛋白。酶與非酶的分析結果表明，EstP 是酶，並且屬於水解酶類。
    　
　　進一步分析發現，EstP 不屬於任何已知的蛋白超家族，與 EstP 具同源性的已知蛋白也非常少。rpsBlast 分析表明，EstP 僅有一段很短的序列（71～149氨基酸區段）與羧肽酶 Taq (M32) 的保守域有最高的相似性，這段序列還與預測膜蛋白 COGO0012 有一定的相似性。

    通過對已知結構蛋白 Taq (M32) 的三級結構的分析發現，其與 EstP 具有同源性的序列呈 V 字型，且Taq (M32) 的活性位點正位於這一區段內，由此，推測 EstP 的活性中心可能位於其 71～149 氨基酸區段內。

　　3  討 論
    　　
　　作為目前最有發展前途的殺蟲劑，擬除蟲菊酯尚未找到新型的替代化合物，在未來十幾年內仍將廣泛使用。采用微生物農藥降解酶解決菊酯農藥殘留汙染問題是當前環境科學研究的熱點,也是一個較新的研究領域。由於農藥降解酶在野生菌株中含量太低，生產成本高昂且難以大量生產，如何產業化地生產農藥降解酶成為農藥降解酶應用必須解決一個關鍵性問題。農藥降解酶基因的克隆、表達以及定向進化可以構建出降解譜廣、降解能力強的工程菌，為微生物降解農藥開辟了新途徑。
    　　
　　在之前的研究中，本實驗室從農藥廠的汙泥中篩選出能降解菊酯農藥的伯雷克氏菌株 Klebsiella sp. Strain ZD112 。通過構建基因文庫的方式，獲得了一個具有菊酯降解活性的克隆子，對測序結果進行 ORF 分析，該ORF1在NCBI上比對的結果都是一些細菌的預測蛋白，如：它與Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis的預測蛋白hypothetical protein SC171(登錄號: AAS76447.1)有88%一致性；與Azoarcus sp. EbN1的預測蛋白ebA4602(登錄號: YP159633.1)有36 %的一致性。他們的功能都還沒有確定,目前為止尚未見有菊酯類農藥降解基因的報道。因此本研究克隆出來的基因有可能是一個新的菊酯農藥降解基因。
    　　
　　對該基因的生物信息學分析顯示，EstP 為水解酶且為胞內蛋白，這與前期實驗結論完全吻合［5］。根據其與羧肽酶 Taq (M32) 保守域所表現的較高相似性，推測其氨基酸序列的 71～149 為其活性中心所在，必需氨基酸為 Glu116, Lys137，Glu148，這一結論的得出為 EstP 的定向進化提供了理論指導。然而，EstP 與其他已知蛋白序列相似性極低，且不屬於任何蛋白超級家族，這增加了對其研究的難度。
    　　
　　對這樣一個全新水解酶的進一步研究，一方麵，可深入了解菊酯降解酶的作用機製［6］，具有深刻的理論意義；另一方麵，高效工程菌的開發有助於菊酯農藥殘留降解，在保護生態環境、突破綠色壁壘、維護人民健康等方麵具有很大的應用潛力。

【參考文獻】
  　　［1］MIYAMOTO J, KANEKO H, TSUJI R, et al. Pyrethroids, nerve poisons : how their risks to human health should be assessed ［J］. Toxicol Lett, 1995, 83: 933-940.

　　［2］PARK E K, KIM J H, GEE S J, et al. Determination of pyrethroid residues in agricultural products by an enzymelinked immunosorbent assay ［J］. J Agric Food Chem, 2004, 52: 5572-5576.

　　［3］虞雲龍，樊德方，陳鶴鑫．農藥微生物降解的研究現狀與發展策略［J］．環境科學進展，1996，4：28-34．

　　［4］CHOI Y J, MIGUEZ C B, LEE B H. Characterization and heterologous gene expression of a novel esterase from Lactobacillus casei CL96 ［J］. Appl Environ Microbiol, 2004, 70: 3213-3221.

　　［5］梁衛驅,劉玉煥，李荷.氯氰菊酯降解菌的分離鑒定及其降解特性研究［J］.廣東藥學院學報,2007,23 (2)：199.

　　［6］皮埃爾·巴迪爾，索恩·布魯納克．生物信息學－機械學習方法［M］．北京：中信出版社，2003：211-219．