一、分子生物學技術在細菌分類中的應用
細菌的傳統分類法和數值分類法以表型特征相似性為基礎，而單純表型相似性還不能準確地確定係統發育關係。隨著分子生物學及遺傳學的發展，細菌分類學中發展了一係列核酸分析方法，包括DNA分子中G＋C百分含量測定、DNA-DNA雜交、16S rRNA相關度分析等。
DNA分子中G＋C百分含量的測定
細菌DNA G+C或A+T摩爾百分比能反映細菌間DNA分子同源程度，不同種屬間G+C mol%範圍在25%~ 75%之間，但同一種細菌G+C mol%相當穩定，不受菌齡、培養條件和其他外界因素影響，親緣關係越近的細菌，G+C mol%越相近，親緣關係較遠的細菌G＋Cmol%也不同，但G＋Cmol%相同或近似其親緣關係不一定相近。最常用的測定方法是熱變性溫度法，其次是高效液相色譜法和浮力密度法。
DNA-DNA雜交
DNA雜交可得出DNA之間核苷酸順序的互補程度，從而推斷不同細菌基因組間的同源性。目前最常用的是複性速率法，變性DNA在溶液中複性（雜交）時，同源DNA的複性速率比異源DNA要快，同源性愈高，複性速率愈快。複性的過程也伴隨著260nm紫外吸收的減少，再通過分光光度計直接測定變性DNA在一定條件下的複性速率，最後用理論推導的公式來計算DNA之間的同源性。同一菌的複性率為100%，80%~90%同源為同一種內同一亞種的細菌，60%~70%同源為同一種內不同亞種的細菌，20%~60%同源則是同一屬中的不同菌種。這種方法還可對新菌種或表型性狀差別很小而難以肯定的菌株做出較可靠的判定，並可修正其他方法的分類和鑒定錯誤。
3．16S rRNA同源性分析
(1) rRNA-DNA雜交：變性rRNA與變性DNA混合時，rRNA與其互補的DNA鏈形成雜交雙鏈，rRNA分子與異源DNA雜交時，也能在其同源區形成互補雙鏈，這種雜交雙鏈的穩定性與其同源性成正相關，適於細菌屬及屬上水平的分類研究。現最常用的是硝酸纖維膜結合法。
(2)16S rRNA序列測定：rRNA分子具有高度保守性，在所有的細胞生物中都存在，在長期的進化中，16S rRNA的總堿基數有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互對齊進行比較。1985年Lane等提出了改良的Sanger雙脫氧鏈終止法測定rRNA序列，以rRNA為模板，以一個或多個寡核苷酸鏈做引物（與rRNA分子上的一段保守區域互補的15~20個核苷酸），用反轉錄酶合成反轉錄DNA。隨著PCR技術的成熟，出現了利用PCR技術擴增16S rRNA基因（rDNA），然後采用Sanger法分析rDNA序列的方法，該法比前者更方便。當前的細菌分類要求測定16S rRNA基因的全序列來進行比較。16S rRNA基因序列分析技術是建立係統分類的主要技術，有人建議DNA相關性≥70%，16S rRNA序列差異≤1%~1.5%的細菌屬於同一種，這使細菌的種有一個穩定和統一的標準。
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