1 、營養源濃度的控製
由於大多數基因重組菌不能把所需的基因產物分泌到胞外，而隻能靠破碎細胞後提取，因此要獲得基因產物，首先必須得到大量菌體。為此基因重組菌的發酵一般采用高濃度菌體培養的方法，如大腸杆菌培養時最高可達 125g 幹菌體 /L 發酵液，釀酒酵母可達 145g 幹菌體 /L 發酵液。但要得到高濃度菌體，必須要提供高濃度的營養物質，而營養源濃度過高，滲透壓也就高，反過來又會抑製重組菌的生長。此外，許多基因重組菌常是維生素或氨基酸的營養缺陷型菌株，為維持菌體生長，也必須添加必需量的生長因子營養物。常采用在調節 pH 的同時補加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。使整個培養期間，葡萄糖和氨基酸的濃度幾乎保持恒定，菌體持續以最高生長速度生長，得到高濃度菌體。
2 、質粒的不穩定性及其控製
在重組菌工業化生產過程中，質粒的不穩定性是一個極為重要而獨特的問題。帶有質粒的細胞生長較慢，生長速率與所帶質粒的大小成反比。此外，高水平克隆基因產物的生成也會導致生長緩慢或生長異常（表達越高，生長越慢）。由於質粒的不穩定性，在繁殖傳代過程中還會有一部分細胞部分甚至完全丟失質粒，導致所需產物的產量下降。
質粒不穩定包括分離性不穩定和結構性不穩定兩種類型。前者是細胞分裂過程中質粒沒有分配到子細胞中而導致整個質粒的丟失；後者是由於重組質粒 DNA 發生缺失、插入或重排而引起的質粒結構變化。
為了在工業化生產時使質粒的丟失降低到最低程度，除了構建合適的重組菌外，還應對重組菌進行一係列發酵試驗，選擇最佳的發酵條件。
使質粒穩定的主要措施：首先是組建合適載體和選擇適當宿主，關於這兩項措施應在構建攜帶質粒工程菌時即應加以考慮。在發酵過程中可以：
（ 1 ）、施加選擇壓力
利用某些生長條件，隻讓那些具有一定遺傳特性的細胞才能夠生長。在重組菌發酵時，常采取這種方法來消除重組質粒的不穩定性，以提高菌體純度和發酵生產率。
抗生素添加法 因重組菌中常含有抗藥性基因，因此可添加相應的抗生素來限製非重組菌的生長。但由於抗生素的存在往往在一定程度上會影響目的產物的合成，增加產物提取的難度，而且對一些易被酶水解失活的抗生素來說，添加抗生素所造成的選擇壓力隻能維持一定的時間。如帶 Ap r 基因的克隆株在 Ap 濃度為 50 、 200 、 1000μg/mL 的培養基中培養 16 小時後，含有重組質粒的細胞數占總細胞數的比例分別為 40% 、 60% 和 100% ，再加上發酵過程中受成本的限製，所以大規模生產時此法並不可取。
抗生素依賴型變異法 通過誘變使受體細胞成為某抗生素的依賴型突變株，即隻有在該抗生素存在時受體細胞才能生長，而重組質粒上含有該抗生素的非依賴基因，將重組質粒導入後，克隆菌能在不含抗生素的培養基中生長。此方法可節約大量抗生素，但克隆菌易發生回複突變。
營養缺陷型法 受體細胞是營養缺陷型的，不能在選擇性培養基上生長，而質粒中含有此基因，克隆後克隆株能在選擇性培養基上生長。如構建帶色氨酸操縱子的重組質粒 pBR322-trp ，在質粒上插入 serB 基因，而受體細胞是 serB 缺陷型的，因此隻有重組菌才能在不含 Ser 的培養基上生長。
（ 2 ）、控製基因過量表達
由於外源基因表達水平越高，重組菌往往越不穩定。因此一般采用兩階段培養法，即在發酵前期控製外源基因不過量表達，使重組質粒穩定地遺傳，到後期，通過提高質粒的拷貝數或轉錄翻譯效率，使外源基因高效表達。
可誘導啟動子 在構建表達質粒時，可以使用可誘導的操縱子，如 lac 、 trp 等。在用含有這些啟動子的克隆菌進行發酵生產時，可以選擇培養條件使啟動子受阻遏（抑製）至一定時期，在此期間質粒穩定地遺傳，然後通過去阻遏（誘導），使質粒高效表達，例如利用 3-β- 吲哚乙酸可以使 trp 啟動子去阻遏。
溫度敏感型質粒 某些質粒在溫度較低時，質粒拷貝數少，溫度升高後，大量擴增，這種質粒稱“脫韁質粒”（ runaway plasmid ），如 pKN402 和 pKN410 在 30℃ 時拷貝數為 20~50 個 / 大腸杆菌細胞，而 35℃ 時大量複製。若將 β- 內酰胺酶基因接在此質粒中，經熱誘導後， β- 內酰胺酶活力可增強 400 倍。
（ 3 ）、控製培養條件
培養基組成 不同的培養基能影響微生物的代謝活動，也能影響質粒的穩定性。有人認為質粒在豐富培養基中比在最低限量培養基中更加不穩定。
培養溫度 含有重組質粒的克隆菌的比生長速率往往比受體菌要小，同樣質粒導入受體菌後會使受體菌的生長溫度改變。通常而言，低溫有利於重組質粒穩定地遺傳。
菌體比生長速率 調整重組菌及受體菌的比生長速率可以提高重組質粒的穩定性，但要做到這一點非常困難，因為大多數環境條件可同時提高或降低這兩種菌的比生長速率。在某些情況下，可以利用分解代謝物效應控製菌的比生長速率，來提高重組質粒的穩定性。如在重組質粒中克隆入抗高濃度抑製的某個基因，這樣在進行高濃度底物培養時，受體菌被抑製，比生長速率下降，而重組菌仍能正常生長。
綜上所述，選定一個合適的受體菌十分重要。基因工程操作中常用的受體菌是大腸杆菌，它最大的缺點是代謝產物很難分泌出胞外，讓枯草芽孢杆菌把代謝產物分泌出來是可能的，但由於產芽孢，難於培養到高濃度，而不產芽孢的變易株往往很難培養，因此應該適當考慮用其他微生物作受體。
為了高效率地生產代謝產物，還應考慮每個細胞的質粒數、質粒的穩定性及轉錄和翻譯的效率等。質粒越多，產量越高，但增殖速度越慢，而且質粒越易脫落，脫落的速度越快；表達水平越高，重組質粒越不穩定。因此在實際生產中可考慮用兩階段培養方式，第一階段主要考慮增殖，第二階段主要考慮目的基因的表達。也可通過改變溫度、用雙罐連續培養等方式，或用添加或去除藥劑的方法來提高基因產物的產量。
3 、工程菌外逸的控製
由構建的工程菌所攜帶的轉入基因對於環境的長期安全性仍具有風險性，目前有關法規都明確規定工程菌不能擴散到自然環境中，因此應采取以下措施以防菌體外逸。
（ 1 ）、排氣控製 排出的氣中含有大量氣溶膠，在劇烈起泡的培養物中，培養液呈泡沫狀，它們從排氣口向外排出，重組菌也容易隨之外漏。
控製辦法：在通用通氣型培養罐上安裝排氣鼓泡器（見圖 7-13 ），氣體通過排氣管到鼓泡瓶，再通過膜濾器，瓶中可加入殺菌劑（如 2N NaOH ），或用電熱器將排氣加熱至 200℃ ，殺滅工程菌。
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