大多數微生物可用超低溫保存，超低溫保存法是適用範圍最廣的微生物保存法。需要複雜營養的微生物種，如用其他的貯存方法不能保持其活力（ 如植物的病原性真菌），通常可用超低溫的方法保存（ATCC 1983；Halliday，Baker 1985）。此法是將凍存在小管或安瓿裏的細胞以較慢的冷凍速率（1℃／分鍾）冷凍，直至—150℃，再將這些小管貯存在—150～－196℃的液氮中。
超低溫的冷凍保護劑不同於凍幹法所用的冷凍劑。ATCC 常用一種由甘油（10％）、二甲亞碸（5％）和培養液製成的混合劑保存多數的細胞株。這些化學試劑進入細胞內可避免內膜的冷凍損傷。
貯存在低溫容器內的細胞複蘇時必須小心操作。當小管被加熱時，所形成的冰晶會將細胞殺死，正確操作就可避免這種事故。隻要迅速將樣品解凍就能減少活力的丟失，做法是：將封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然後打開管口，將內容物移入培養基。
超低溫保藏的微生物必須始終貯存在溫度非常低的環境中，因此需要液氮罐。在長期貯存的過程中必須經常注意補充液氮。這種貯存方式比凍幹法需要更多的經費，包括為了維持貯存溫度所必要的勞動力和液氮等。
1 材料
病毒超低溫保存所需材料有：熱收縮塑料管（Nunc Cryoflex），液氮罐，防護手套和麵罩，永久性記號筆，氣體噴燈，裝液氮的保溫瓶。
2 方法
（1）剪一段兩端各超出冷凍管長度2cm 的熱收縮塑料管。
（2）將含有澄清病毒懸液（組織培養的上清培養基，或組織培養基內的細胞溶解產物均可）冰浴幾分鍾，用滅菌移液管將0.2ml 冰浴過的上清懸液分裝到冷凍管內，並將蓋子擰緊。
（3）將有病毒的冷凍管放入熱收縮塑料管中部，插入正確的標簽。
（4）用噴燈小心加熱熱收縮塑料管，並使之包住冷凍管。注意不要用太高的溫度加熱熱收縮塑料管。
（5）再小心加熱熱收縮塑料管的兩端，用大號鑷子夾緊管的端口至完全密封。
（6）將密封好的冷凍管快速在裝有液氮的保溫瓶中冷凍（操作時要求戴麵罩和手套）。
（7）將冷凍過的冷凍管放入液氮罐中的格子內，同時記錄樣品的詳細的存放位置、實驗編號和存放日期等。
（8）需要用時，迅速從液氮罐內取出所需樣品，並投入37℃水浴箱中解凍後，用解剖刀片在冷凍管的矽化墊圈處切開熱收縮塑料管。擰開冷凍管的蓋子時不需要除去熱收縮塑料管。
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