一．目的
掌握缺口平移(Nick--Translation)標記DNA探針的原理和方法,掌握同位素探針檢測植物病毒的方法。
二.原理
核酸雜交是指兩條來源不同的單鏈核酸依據堿基互補配對原理，在一定的溫度和離子強度條件下會形成穩定的異質雙鏈的過程。已知序列的核酸片段（可用放射形同位素或地高辛、生物素等非放射性標記物標記）稱為探針，被檢測的核酸稱為目標核酸。常用的探針標記方法有缺口平移、隨機引物、末端標記及RNA探針等。缺口平移的方法是基於低濃度的DNA酶Ⅰ在Mg2+存在的條件下，能在DNA鏈上隨機產生遊離的3 ′-OH末端缺口。大腸杆菌DNA聚合酶Ⅰ能夠催化一個核苷酸加到3 ′-OH端的缺口上。同時,DNA聚合酶Ⅰ的5 ′→3 ′的外切酶活性能夠將核苷酸從缺口的5 ′-P末端 除去。一個新的帶3 ′-OH的核苷酸被摻入原來被切去的核苷酸的位置上,這樣切口就向3 ′方向移動了一個核苷酸。這種3 ′端移動使帶標記的核苷酸能順序地代替原先被除去的核苷酸而摻入到DNA 中,用此方法製備的探針被廣泛地應用於各種雜交技術中。
三.材料及試劑
感病植株番杏，健康植株(作為陰性對照)，已知病毒或含有病毒基因的質粒陽性(作為陰性對照)。用於標記探針的模板(PCR產物、或回收的DNA片段)。
植 物 總 RNA 抽 提 緩 衝 液 ( 內 含1%SDS 、20mMTris-HCL 、200mMNaCl 、5mMEDTApH7.8),苯酚:氯仿:二異戊醇(25 ∶24 ∶1),Nick-TranslationKit(內含DNA酶Ι和DNA 聚合酶Ι的混合液,10 ×Nick-Translation 緩衝液、dNTP), α-P32-dATP 、20 × SSC(175.3g氯化鈉,88.2g檸檬酸鈉,蒸餾水定容至1000ml,pH7.0)、50 ×Denhardt’s試劑(5g聚蔗糖Ficol、5g聚乙烯吡咯烷酮PVP、5g牛血清白蛋白BSA,蒸餾水定容至500ml)。予雜交液( 內含5 ×SSC、5 ×Denhardt ′s試劑、0.1%SDS.50% 甲酰胺、100ug/ml鮭精DNA)。
尼龍膜，水浴搖床、封口機雜交爐和雜交瓶，X光片、卡式暗盒、保鮮膜或同位素感光板。
X光片顯影液(3.5g米突爾、60g無水亞硫酸鈉、9g幾奴兒、40g無水碳酸鈉、3.5g溴化鉀於50℃溶解,蒸餾水定容至1000ml)。X光片定影液(120g硫代硫酸鈉、7.5g無水亞硫酸鈉、6.3ml冰乙酸、3.75g硼酸於30 C溫水溶解,當水溫低於30℃時加入7.5g硫酸鋁鉀,蒸餾水定容至500ml)。
四.步驟
1.樣品的製備，參見RNA提取實驗
2.點雜交
⑴．尼龍膜處理：將尼龍膜用ddH2O浸透後,放入5 ×SSC中浸5分鍾。
⑵．點樣：將尼龍膜從5 ×SSC中取出,放於濾紙上,分別點上樣品,陰性對照和陽性對照各1-5μl （dsDNA樣品需變性後點樣）。可用狹槽裝置（slothybridization）點樣。
⑶．膜的幹燥及固定：將膜在室溫中晾幹或用吹風機吹幹後,放入80℃烘箱中烤兩小時或120℃半小時。
⑷．予雜交：將固定好的膜放入ddH2O中浸潤後,於5 ×SSC中浸5分鍾，裝入雜交袋或雜交瓶中，加入予雜交液3-5ml（雜交袋需趕完氣泡後用封口機封口），42 ℃予雜交3小時以上。
⑸．探針的製備：0.5-2ug回收的探針模板DNA, 5 μldGTP、dCTP、dTTP混合物(濃度均為0.4mmoi/L), 0.5uldATP(0.4mmol/L), 5ul10 ×Nick-Translation buffer, 2.5 μl α-P -dATP, 加ddH2O至50 μl, 混勻,15℃保溫1小時後, 加5 μl0.25MEDTA終止,100℃變性5分鍾,使DNA變成單鏈探針,置於鉛罐內,-20℃保存。
⑹．雜交：將經變性的DNA探針加入含有預雜交液的雜交袋(瓶)中,42℃雜交16小時以上。
⑺．洗膜：用1×SSC(含0.2%SDS)洗膜兩次,每次各15分鍾；用0.2×SSC(含0.2%SDS)洗膜2-3次,20-30分鍾。每洗完一次膜用同位素檢測器檢測放射強度,洗至陰性對照處計數很弱,陽性對照處仍很強。
⑻．壓片：將洗好的膜放在濾紙上稍幹,吸去多餘的水分,用保鮮膜將膜包好,固定在卡式暗盒的增感屏上,在黑暗中(可以在紅光下)將X光片取出,壓在膜上,蓋好暗盒,並用膠布將口封住,將暗盒放入-20℃冰箱中過夜(陳舊同位素可稍長)。
（9）衝片：將X光片於紅光下取出放入顯影液中3-5分鍾(以顯出影相為準),將X光片放入水中漂洗一下,放入定影液中固定10分鍾後即可取出。
注：也可用同位素感光板快速壓片。
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