一. 目的
掌握RT-PCR技術的一般原理和操作步驟
二.原理
PCR(聚合酶鏈式反應)技術是利用從嗜熱水生菌(Thermasaquaticus)中提取或經基因重組合成的耐熱DNA聚合酶(常用TaqDNAPolymerase)在高溫下快速擴增位於兩段已知序列之間DNA片段的技術。PCR過程包括：一.DNA模板的變性(94-95℃),二.單鏈DNA模板與引物的退火(45-55℃)，三.引物的延伸(72℃),這三步經25-30個循環而完成了PCR的全過程 。
三.材料、試劑及儀器
病毒侵染的植株和健康對照總RNA或病毒RNA，3 ’特異性引物1，5’特異性引物2 ，AMV 反轉錄酶，5X 反轉錄buffer ，10mMdNTP，TaqDNAPoiymerase ，10 ×TaqDNAPoiymeraseBuffer(內含50mM/LKCL 、10mM/LTris.Cl(pH8.3)、1.5mM/LMgCL),ddH2O。
液體石蠟，小離心管，移液器，PCR擴增儀。
四.步驟
1．反轉錄（RT ）
反應體係：
ddH2O μl
5X反轉錄Buffer 10μl
10mMdNTP 3 μl
RNasin 40u
模板RNA 0.1-1 μg
3’端特異引物 0.1 μg
AMV反轉錄酶 10
總體積 50 μl
反應條件：42℃ 1-2小時。
2．PCR擴增
反應體係：
ddH2O μl
10×PCRbuffer 10μl
10mMdNTP 0.5 μl
5’引物(0.1ug/ μl) 1μl
3’引物(0.1ug/ μl) 1μl
TaqDNAPolymerase 2-5u
模板反轉錄產物 1-5μl
總體積 50 μl
石蠟油 70 μl
反應步驟：
循環變性退火聚合
1 94℃ 5分鍾 55℃ 1分鍾 72℃ 2分鍾
2 94℃ 1分鍾 55℃ 1分鍾 72℃ 2分鍾
末輪循環 94℃ 1分鍾 55℃ 1分鍾 72℃ 7分鍾
3. 電泳檢測與分析
PCR反應完畢，取6-8 μl反應產物於0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇合適的DNA 分子量標準作對照。
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