一. 目的
植物病毒中,絕大多數核酸為RNA,為研究病毒核酸組分結構及功能,首先要將病毒的核酸分離、提取。本實驗即學習用酚-SDS法提取病毒RNA.
二.實驗材料
純化TMV、CMV或其它病毒等.
三.實驗用儀器及藥劑
高速離心機，真空幹燥儀，微量取樣器，1.5mL離心管
抽取緩衝液(20mMTris-HClpH8.0；1%SDS；200mMNaCl，5mMEDTA)
飽和苯酚/氯仿(1 ∶1)，氯仿/異戊醇(24 ∶1)，預冷100%和70%的乙醇，DEPC處理後滅菌蒸餾水。
四.實驗步驟
1.取適量病毒提純液20～100μl,加滅菌蒸餾水至200 μl
2.加入等體積(200 μl)抽提緩衝液
3.加等體積飽和苯酚/氯仿(400 μl)，輕微振蕩混合2-5分鍾
4.12000rpm離心2分鍾
5.取上清水相，再加等體積飽和苯酚/氯仿，混合抽提
6.12000rpm離心2分鍾
7.加等體積氯仿/異戊醇(24 ∶1)抽提一次
8.取上清水相加2.5倍體積無水冷乙醇，混勻、置-20℃下2小時
9.12000rpm離心15分鍾
10.倒去乙醇,沉澱用70%冷乙醇(0.5ml)洗滌2次
11.真空幹燥,3～5分鍾
12.沉澱溶於20 μl滅菌蒸餾水中,-20℃保存
13.取5 μl病毒RNA稀釋到1ml,測O.D260，計算5 μl裏RNA含量。
核酸、蛋白、病毒的濃度:
1.核酸溶液:
雙鏈RNA或DNAO.D260 ≌1時為50 μg/ml(微克/毫升)
單鏈RNA或DNAO.D260 ≌1.3時為50 μg/ml
雙鏈DNA濃度=[(G+(摩爾數)+14.19]/8.63≌1.7克/毫升
RNA密度≌1.9g/ml
2.蛋白質溶液:
O.D280 ≌1.0時為1mg/ml
含有核酸的蛋白質,其濃度(mg/ml)=1.5O.D280 －0.75O.D260
3.病毒:
0.1%
病毒濃度(mg/ml)=O.D260 ×稀釋倍數/E1cm 260nm
病毒產量(mg/kg)=病毒濃度×提純總ml數×1000/組織重(g)
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