1 前言
眾所周知，傳統習慣程序的痰標本細菌學檢驗其臨床符合率並不高,其原因是多方麵的。除了痰標本采集不規範導致的不合格標本帶來的培養結果與病人感染不相符外，還因為微生物和人體的相關性本身就具有複雜性：源自細菌的致病與條件致病的辨證性，如致病菌可能為正常攜帶，而細菌在肺通氣功能異常病人的下呼吸道的可以發生單純定植或感染，要證明培養結果與感染的相關性是醫學微生物學所麵臨的難題，這也使得一直以來在對於痰培養的標準化進展十分緩慢，以至在各版《全國臨床檢驗操作規程》上也未提出相應詳細可行的令全國同行公認的統一規範的標準化操作程序（SOP）和完整的痰液培養的質量控製辦法。習慣程序的痰標本細菌學檢驗的緩慢也很不適應臨床診斷治療的迫切性[1]。故而，建立規範而快速的痰液細菌學檢驗的SOP對於提高呼吸係統感染病的診治水平和控製抗生素的濫用等問題均有重要的作用
痰培養陽性率普遍教低，臨床符合率差的關鍵因素是痰標本采集不規範，不合格痰標本將直接導致病原菌被分離的機會降低，大量正常菌群也會抑製病原菌的生長或幹擾病原菌的檢出，降低了臨床符合率；再有就是操作程序的不規範，不重視直接塗片，檢驗過程控製的不嚴密也是導致臨床符合率低的重要原因。我們通過SOP的臨床應用情況的分析，痰培養陽性率和臨床符合率均可能被提高，並且細菌分布統計結果顯示本文與國外文獻所報道的情況基本一致[2]。
對於直接塗片的意義，在於判斷標本中微生物有無、類型、染色特性、形態特征，標本的汙染情況，還可對痰標本中可能的病原菌初步診斷(依據人體被病原菌感染後的炎性滲出包裹和白細胞吞噬反應)，判斷是否存在複數菌感染，動態觀察處於治療過程中不同時期所送檢的標本中病原菌情況的變化（如同種病原菌數量的增減，機體的免疫反應，菌群的交替）。甚至可以推斷臨床治療療效和病人病情的變化和轉歸，醫院內感染的發生等，具有重要意義[3]。
為了滿足高質量需求，對首代分離培養基應該進行嚴格的質量控製[4]。另外，對首代分離培養基的選用和搭配的合理化也需要進行探討。
為了縮短鑒定時間，在細菌鑒定中可采用酶法鑒定：所謂酶法鑒定：國外八十年代中一些微生物學家在研究中發現由於細菌在生長分裂過程中細胞內集聚了大量的與物質代謝相關的各種酶類，可在短時間內釋放到胞外（稱胞外酶）可迅速分解相應底物。故而，當在高靈敏微量生化反應培養基中加入大量濃厚的菌液時，則無須細菌繁殖就能在短時間內產生反應。根據這一理論采用高靈敏微量生化反應單元與數值分類法相結合而成的酶法生化編碼鑒定係統可對細菌進行快速鑒定（如API rapid 20E/NH 11n、Sensititre AP80、MicroScan Rapid Neg ID3、Vitek GNI+、RapID onE、超聲波輔助快速酶法革蘭陰性杆菌鑒定係統[5~14]），鑒定時間可縮短至4~6小時。但鏈球菌因為首代分離生長慢，菌落細小，不能收集充足菌量，暫不能采用酶法鑒定，其鑒定仍沿用常規生化反應鑒定或免疫學方法鑒定.
2 標準化操作程序
2.1標本接收篩選方案：
目測：黃色、灰色、血性、鐵鏽色，渾濁、 稠厚，呈現團塊狀的標本為合格標本；
而無色透明、有灰白片狀物或黑色小點，有明顯食物渣滓、紙屑灰塵的為不合格標本。
顯微鏡下篩選：對經過目測篩選的標本，在洗滌前還須再經過顯微鏡下篩選：取約 0.1ml痰液（黃豆大小）用接種環均勻塗布成2×2cm2大小的塗膜，在顯微鏡下，凡膿細胞>25/LP且鱗狀上皮<10/LP的標本為合格標本，可進入下一步程序；而膿細胞<10/LP但細菌數量>+++或鱗狀上皮>25/LP的標本為不合格標本，應拒收。
2. 2標本預處理：[/align][align=left] 按《全國臨床檢驗操作規程》（第2版）相關章節，采用先用20ml生理鹽水洗滌兩次，經過10ml生理鹽水稀釋後，加入1%的PH7.6的胰蛋白酶溶液消化90min後接種。並同時在洗滌後製作原始痰塗片，進行染色鏡檢。
2. 3讀片：根據人體對細菌/真菌感染在早期主要以非特異性免疫的細胞免疫為主的特點，結合呼吸係統生理病理特點，闡述痰液形成過程和排出過程，我們可以得知，在下呼吸道中感染中形成的炎性滲出、包裹物中存在與感染直接相關的病原菌，在自然排痰的過程中會被上呼吸道的正常菌群所汙染，但汙染菌位於炎性包裹物之外，且人體對正常菌群具有共生性保護因而不會產生吞噬現象，借此理論，我們將選擇痰標本中膿細胞成團塊狀分布，集中而不稠密，且周圍無鱗狀上皮細胞或無大量成團狀分布的細菌球的區域為讀片區，認真收尋20~30個視野中膿細胞聚集處的膿細胞胞漿中有無吞噬的細菌及細菌的染色排列特征，菌體特征（如粗細、長短、扭曲）並作記錄，將此作為確定病原菌的理論依據。
2.4標本的接種培養：一般情況接種BA、Choc（含萬古黴素50mg/L）、麥康凱/MecK(即“分科瓊脂”NBIIA)、CHROMagar，BA、Choc置5%CO2、35℃潮濕環境培養，麥康凱/MecK、CHROMagar置普通環境35℃培養；懷疑為軍團菌的加種BCYE-а培養基，懷疑為百日咳的加種Boudet-Gengou培養基，懷疑為肺結核的加種羅-瓊氏培養基或采用商品化專門的分枝杆菌培養基培養；懷疑為肺炎支原體感染的加種Hayflick雙相培養基或采用免疫學及分子生物學方法檢測，肺炎衣原體須用免疫學或分子生物學方法。
2.5讀碟：（經過18~24h隔夜培養，但孿生球菌、營養缺陷鏈球菌以及分枝杆菌則需延長培養時間）
2.5.1 G+菌：BA生長、Choc不生長、MecK不生長，——Gram染色：分G+co（革蘭陽性球菌） ,G+ b（革蘭陽性杆菌）
2.5.1.1 G+co—依靠溶血特征，菌落形態、菌落顏色、菌體形態區分:
葡萄球菌：淡黃色/白色，中等大小，較凸，規則圓形，β/γ溶血，較濕潤，除金黃色葡萄球菌外，一般不具有臨床意義；
微球菌：黃色/白色/橙色，中等大小，較凸，規則圓形，不溶血，較幹燥，不易乳化較葡萄球菌生長緩慢，該菌一般無臨床意義；
鏈球菌：白色/灰白色、凸起小菌落，β溶血為溶血型鏈球菌；灰白隆起中心扁平或凹陷，1.0-1.5mm大小的寬大а溶血為肺炎鏈球菌，該菌是最常見的肺部感染病原菌，在社區獲得性感染中有重要的地位；細如針尖，白色凸起а溶血的為草綠色鏈球菌，自然咯痰標本中的草綠色鏈球菌一般不具有臨床意義；
腸球菌：灰白，低凸，2.0mm左右之а溶血菌落，較濕潤，但一般不具有臨床意義；
口腔球菌：白色凸起較大菌落，不溶血，黏著，接種針挑之則整個菌落挑起，瓊脂上不留痕跡。該菌偶爾可引起肺部的嚴重感染，一般好發生於COPD病人和肺氣腫病人；
孿生球菌：白色、凸起細小菌落，β溶血，生長慢48h僅0.2~0.4mm，在含羊血的MH瓊脂上不生長。該菌是上呼吸道的正常菌群組成之一，一般不導致肺部感染；
2.5.1.2 G+ b—依靠溶血特征，菌落形態、菌落大小、菌體形態區分：
棒狀杆菌：白色1.0-1.5mm左右大小，較幹燥，不溶血/狹窄β溶血的為白喉或一般棒狀杆菌；小而濕潤，灰白/無色，半透明的為J-K棒狀杆菌；灰白細小，β溶血的可能為假結核、化膿放線菌、溶血分泌杆菌；除白喉杆菌外，假結核、化膿放線菌、溶血分泌杆菌是罕見的咽喉部病源菌，棒狀杆菌一般不導致肺部感染；
乳杆菌：細小，白色凸起а溶血菌落，有特殊的酸臭味，口腔正常菌群，無臨床意義；
芽孢杆菌：灰白大菌落，表麵粗糙如毛玻璃狀、蠟狀、邊緣不規則，不同種類菌落形態差異巨大，寬大β溶血。延長培養時間，菌落從濕潤變得幹燥，邊緣呈放射狀擴散，形成葉狀、掌狀、雪花狀、齒輪狀等，常常為痰培養的汙染菌；
BA生長、Choc生長、MecK不生長，——Gram染色：G+co
平麵球菌、藻球菌：血瓊脂上為а溶血，0.5-1.0mm大小，在Choc上呈現金屬色澤，無臨床意義。
2.5.2 G-菌：根據形態分為G- b（革蘭陰性杆菌） 、G-co（革蘭陰性球菌） 、以及根據對特殊營養的需求對苛養性G- b進一步分類，常見的如嗜血杆菌，軍團菌等：
2.5.2.1 BA生長、Choc生長、MecK生長，——Gram染色：G- b—氧化酶、分科瓊脂顏色
腸杆菌：氧化酶（-），分科瓊脂上黃色濕潤大菌落；
弧菌：氧化酶（+），分科瓊脂上淡黃色扁平大菌落；
非發酵菌：氧化酶（+/-），分科瓊脂上藍色/無色透明小菌落—鮑曼不動杆菌為中等大小，菌落聚集處產不擴散黃色色素，分離菌落為蘭色；
2.5.2.2 BA生長、Choc生長、MecK不生長，——Gram染色：G-co—氧化酶（+）、觸酶（+）
奈瑟菌：白色/黃色中等大小菌落，該類細菌為口腔常見正常菌群，該菌在痰培養中含量的高低反應了標本采集狀態的合格程度，大量出現提示培養結果將是不可信的；
卡他莫拉菌：白色小菌落（24h內），菌落有脆性，用接種環推之可移，是兒科和老年病人常見的下呼吸道病原菌；
2.5.2.3 BA不生長/細小、Choc生長、MecK不生長，——Gram染色：G-b、菌體細小或呈扭曲之長絲狀
嗜血杆菌：灰色/無色，半透明，1.5-2.0mm的多為流感嗜血杆菌，該菌為最常見的肺部感染病原菌，可發生於各個年齡層次，其高攜帶與COPD發病有較強的相關性；灰色略黃，不透明，1.0-1.5mm的多為副流感嗜血杆菌。一般副流感嗜血杆菌不導致肺部感染，大量出現提示培養結果將是不可信的；
2.5.2.4 BA不生長、Choc不生長、MecK不生長、BCYE-а生長/或在含有L-半胱氨酸、鐵離子、複合抗生素選擇劑的強化血瓊脂上生長—Gram染色：G-b、菌體細、長絲狀
提示可能為軍團菌：該菌在BCYE-а上48~72 h為中等大小扁平菌落，灰白色，較粘著；該菌具有較強的生物危險性，其中嗜肺軍團菌可傳染；
2.5.3真菌及奴卡菌：BA、Choc、分科瓊脂、CHROMagar均生長—Gram染色形態、生長速度
真菌：酵母樣真菌，菌落中等大小，生長快，多數可在CHROMagar上顯色；大多為口腔咽喉正常菌群，一般不導致肺部感染，但免疫缺陷、糖皮質激素、長期大劑量的抗生素使用可增加該類微生物機會感染的可能性；
煙曲黴菌，絲狀真菌菌落，35℃培養24~48h時菌落為白色泛綠，72h後菌落迅速轉為褐色，中心粉末狀背麵為黃褐色如煙熏狀，該菌為肺部最常見的條件致病菌，感染時患者症狀重，預後非常差；
奴卡菌：小菌落，生長慢，菌落皺褶，呈顆粒狀，有時產生褐色、黃色、黑色等色素，該類細菌可導致肺膿腫，標本膿性，有硫磺顆粒者應高度懷疑該菌；
2.5.4肺炎支原體：固體培養基上，低倍鏡或解剖顯微鏡下為典型“荷包蛋”樣菌落，在Hayflick雙相培養基的液體中使培養基變黃，該類微生物是最常見的非典型性肺炎的病原體，在社區獲得性感染中有著很高的比例。
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