五種培養基分離E1-Tor霍亂弧菌比較

4號 、慶大 、亞膽 、亞洗、雙洗都是分離 El—Tor霍亂弧菌的常用培養基。我們利用浙江省衛生防疫站製備的上述幾種培養基成品，對汙染不同量 El—Tor霍亂弧菌的大便標本進行了分離培養，現將實驗方法和結果報告如下：

1 材料與方法

1.1 抑製劑

1.1.1  1％ 亞碲 酸鉀 ；

1.1.2  250μ/ml慶大黴素(蕪湖製藥廠)；

1.1.3  10％膽汁酸鹽；

1.1.4  1500μ／ml多粘菌素 B(英國進口)；

1.1.5  0.1％硫酸雙氫鏈黴素(上海第十製藥廠)；

1.2 培 養基

1.2.1  堿性腖水   取堿性腖水粉末 26g，加 l000ml蒸餾水，加熱溶解，分裝試管，15磅 15min高壓滅菌。

1.2.2  堿性瓊脂   取堿性腖水粉末26g，牛肉膏3-5隻，加1000ml蒸餾水，加熱溶解，校正 pH8.4，分裝，加 1.2％瓊脂粉，15磅高壓滅菌，待冷至 5O℃左右，傾注滅菌平皿。

1.2.3  4號瓊脂   取4號瓊脂粉44g，加1000ml蒸餾水，加熱溶解，煮沸二次，待冷至50℃左右，加 1％亞碲酸鉀 lml，500μ／ml慶大黴素 lml，充分混勻 ，傾注滅菌平皿。

1.2.4  亞膽瓊脂  取亞膽瓊脂粉42g，加 1000ml蒸餾水，加熱溶解，15磅高壓滅菌，待冷至50℃左右，加10％膽汁酸鹽 15ml，1％亞碲酸鉀 lml，充分混勻，傾注滅菌平皿。

1.2.5 慶大黴素瓊脂  取慶大黴素瓊脂粉53g，加1000ml蒸餾水，加熱溶解，15磅高壓滅菌，待冷至 50℃左右，加250μ／ml慶大黴素2ml，1500μ／ml多粘菌素 B 2ml，充分混勻，傾注滅菌平皿。

1.2.6 亞洗瓊脂 取蛋白腖20g，氯化鈉5g，洗衣粉(上海 )2.5g，牛肉膏 3—4g，先加少量蒸餾水溶解，再加蒸餾水至 l000ml， 校正pH8.4，加1.2％瓊脂粉，15磅高壓滅菌，待冷至50℃左右，加1％亞碲酸鉀1ml，充分混勻，傾注滅菌平皿。

1.2.7 堿性瓊脂斜麵   高壓滅菌。

1.2.8  0.85％生理鹽水  高壓滅菌。

1.2.9  El—Tor霍亂弧菌(係1980—1981年各縣分離上送菌株)；

80—953號：稻葉非溶複株(黃岩)；80—409號：稻葉複愈株(臨海)；80—1124號：稻葉複愈株(三門)；81—1號：小川溶源株(溫嶺)；81—166號：小川複愈株(黃岩)；81—118號：小川 複愈株(黃岩)。

1.2.10 大便標本   采自台州醫院腸道門診化驗大便，共30 份，其中：粘液便8份、稀便4份、水樣便1份、膿血便1份、黃軟便16份。

1.2.11  霍亂弧菌“O”多價診斷血清  係上海生物製品研究所提供，效價1：1280／+，經 1：20稀釋使用。

1.3 方法

1.3.1 用細竹簽挑取2g左右大便，接種於堿性腖水管內，置37℃增菌6h。

1.3.2 將37℃12h斜麵瓊脂培養後的El—Tor霍亂弧菌，用滅菌生理鹽水洗下，用比濁法測定弧菌量，並稀釋成 64萬個／ml、32萬個／ml、16萬個／ml、8萬個／ml、4萬個／ml弧菌懸液，然後，吸取 1ml加入增菌後的腖水管內，充分混勻，置室溫30min。

1.3.3 用同一接種環挑取上述含有不同菌量El—Tor霍亂弧菌的大便增菌液，分別以一滿環劃種於已烘幹表麵水份的亞洗、慶大、雙洗、亞膽，4號各一隻培養基上，經37℃12h及24h 培養後，分別觀察結果。

1.3.4 挑取 El-Tor霍亂弧菌可疑菌落，用1：20稀釋的霍亂弧菌“O”多價血清做玻片凝集；陰性者，再挑選5-10隻菌落凝集。

2 結果

2.1 五種培養基分離人工汙染 El—Tor霍亂弧菌，結果見表 1。

表 1 五種培養基分離人工汙染 El—Tor霍亂弧菌結果

注 ：表內 “+”表示 陽性 ，“-”表 示陰性

從表 l可知，五種培養基同時分離30份人工汙染 El—Tor 霍亂弧菌，經37℃12h培養，4號、慶大、亞膽、雙洗、亞洗平板檢出率分別為 90.0％、33.3％ 、6.7％ 、20.0％、0％；經 37℃24h培養，其檢出率分別為 90.0％ 、40.0％ 、23.3％、20.0％、6.7％。 經χ²檢驗五種培養基檢出率有非常顯著差異(P<0.01)4號培養基檢出率顯著高於其它四種培養基。

2.2 不同血清型 El—Tor霍亂弧菌在4號培養基上檢出率比較見表 2。

表 2 不同血清型 El—Tor霍亂弧菌

在 4號培養基上的檢出率比較

P<0.11差異無顯著性(直接計算法)

3 討論

3.1 人工汙染不同菌量El—Tor霍亂弧菌(6株)的30份大便標本，在4號、慶大、亞膽、雙洗、亞洗培養基上的陽性檢出率，分別為90.0％、40.0％、23.3％、20.0％、6.7％。實驗表明：用4號平板分離El—Tor霍亂弧菌陽性檢出率顯著高於其它四種培養基。而慶大、亞膽、雙洗、亞洗之間的檢出率除慶大與亞膽外，其餘均無顯著差異。

3.2 4號培養基能提高陽性檢出率的主要原因是培養基中亞硫酸鈉及檸檬酸鈉能促進E1一Tor霍亂弧菌的生長。使菌落大而典型；豬膽法(或膽法酸鹽)也能促進 El—Tor霍亂弧菌的生長，並有一定的穩定保護作用，減少抑製劑對弧菌的影響；十二烷基硫酸鈉作為表麵活性 劑能減少培養基的表麵張力，使部分雜菌崩解，同時也有利於El—Tor霍亂弧菌的生長：采用亞碲酸鉀、慶大黴素及雷佛奴爾作為抑製劑，能抑製在部分的革蘭陽性菌及部分腸道革蘭陰性菌，相互之間又有協同作用，增加了抑菌譜；因此，在平板中雜菌幾乎全部被抑製，E1- Tor霍亂弧菌呈純培養，致使早期就能在原始劃線區檢到少數El—Tor霍亂弧菌菌落，從而提高了陽性檢出率。

3.3  4號平板分離El-Tot霍亂弧菌有以下幾個優點：

3.3.1 菌落典型。即菌落較大，中心黑色，扁平、光滑周圍、整齊並且比較透明。容易和其它雜菌鑒別。

3.3.2 抗原性強。El-Tor霍亂弧菌菌落很易挑起乳化，能和霍亂“O”多價血清迅速凝集。

3.3.3 EI-Tor霍亂弧菌不同血清型間的檢出率沒有顯著差異。

3.3.4 檢出率高，檢出時間短。

實驗表明：4號培養基幹粉具有配製簡便，不需高壓，檢出快速，陽性率高，抑製雜菌效果好，觀察結果方便等優點，實為我們實驗室分離El—Tor霍亂弧菌理想的一種培養基。

作者：鄭官增

作者單位：台州市疾病預防控製 中心，浙江 318000

參 考 文 獻

[1]李影林 主編 ．臨 床微生物學 及檢驗 [M]．吉林 科學技術 出版社， 1991；9：245—253．  ’

[2]衛生部疾病控製司編 ．(第 5版)．霍亂防治手冊。1999：48—111．

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