摘要： 對微生物轉化技術在現代醫藥工業應用上的獨特優勢，特別是在手性藥物或藥物中間體製備、借助微生物轉化手段實施組合生物催化在新藥篩選方麵發揮的積極作用進行了闡述分析，並結合作者自身近年來在該技術領域的實踐和收獲對數個相關課題作了介紹。
關鍵詞： 微生物轉化技術； 生物催化； 關鍵中間體
Application of microbial transformation in modern pharmaceutical industry
KEY WORDS Microbial transformation; Biocatalysis; Key intermediates
1 概述
在過去的30多年中，微生物轉化或酶轉化技術在有機化學合成領域中的嚐試不僅使理論研究獲得廣泛開展，在實際應用方麵也取得了長足的進步。許多化學合成工藝相當複雜的藥物、食品添加劑、維生素、化妝品和其它一些精細化工產品合成過程中的某些重要反應，目前已經能夠用微生物或酶轉化技術得以替代。在許多國外文獻中經常能夠看到的描述這種技術的名詞有：microbial transformation、microbial conversion、biotransformation、biotransconversion和enzymation等［1，2］。微生物轉化的本質是某種微生物將一種物質(底物)轉化成為另一種物質(產物)的過程，這一過程是由某種微生物產生的一種或幾種特殊的胞外或胞內酶作為生物催化劑進行的一種或幾種化學反應，簡言之，即為一種利用微生物酶或微生物本身的合成技術。這些具有生物催化劑作用的酶大多數對其微生物的生命過程也是必需的，但在微生物轉化過程中，這些酶僅作為生物催化劑用於化學反應。由於微生物產生的這些能夠被用於化學反應的大多數生物催化劑不僅能夠利用自身的底物及其類似物，且有時對外源添加的底物也具有同樣的催化作用，即能催化非天然的反應(unnatural reactions)，因而微生物轉化可以認為是有機化學反應中的一個特殊的分支。某種特殊的微生物能夠將某種特定的底物轉化成為某種特定的產物，其本質是酶的作用。因此，對酶轉化無需多作解釋，它與微生物轉化的差別僅在於：前者是一個單一的酶催化的化學反應，而後者為了實現這一酶催化反應，需要為微生物提供一個能夠生物合成這些酶的條件，因此，從這一角度來看，這似乎是真正的生物轉化。另外，盡管用於生物轉化的酶大多來自於微生物，但也可以是來自於動物和植物的酶。而對於一個具體的生物轉化來說，究竟是采用微生物轉化技術，還是采用酶轉化技術，這要綜合考慮實現這一過程的諸多因素，如成本、環境、技術裝備和質量要求等。在研究一個微生物(或酶)轉化過程時，需要仔細地考慮諸多方麵的問題如：所用轉化底物的選擇、所用微生物對不同底物轉化能力的考察、轉化路線或轉化反應的選擇等。其中最主要的是尋找適合於所設計轉化過程的微生物，以及如何來提高這種微生物的轉化能力，即提高這種酶活力。再則是發現一種新的酶或一種新的反應以便為設計一個新的微生物轉化過程提供一條線索。為了尋找能夠適合作為生物催化劑的微生物酶，除了有必要對原來已知的一些重要的酶或反應進行重新評價外，一種更為有效的方法是篩選新的微生物菌株或酶［3～6］。用於微生物轉化的菌株或酶的篩選的範圍應該盡可能地廣，因為至目前為止已經發現了3000餘種能夠催化各種化學反應的酶，其中有些酶的催化效果比化學催化劑好；另外，微生物的多樣性和其生理生化特性的多樣性(它們能夠修飾和降解許許多多有機化合物)，使我們有可能找到某種微生物或酶來催化某種特定的和所期望的化學反應。
2 生物轉化與藥物開發的應用
愈來愈多的研究表明，作為治療用藥物的外消旋體混合物有著不可避免的缺點，而美國FDA公布的手性藥物指導原則無疑加快了從頭開始開發單一異構體藥物或利用外消旋體轉換技術從已有的藥物中開發單一異構體藥物的步伐。手性藥物製備的關鍵技術是不對稱合成技術。多年來，有機化學工作者已經研究開發了許多種用化學的方法進行不對稱合成的技術，但近20多年來，很多長期從事化學合成研究的工作者對微生物和酶反應發生了興趣，與此同時，很多長期從事微生物和酶的研究的工作者對如何將此應用於有機合成發生了興趣，從而使生物催化轉化(biocatalytic transformation)成為一種進行不對稱合成的重要技術。應用生物催化轉化技術進行不對稱合成與化學合成法相比較具有的優越性有：1)轉化底物某一基團的專一性強，即對不需要轉化的基團無需保護；2)通過對用於某一轉化的微生物進行菌種選育和轉化條件的優化，可以得到極高的轉化率；3)生物催化轉化的反應條件溫和且對環境的汙染很小。特別是近年來DNA重組技術的應用和新的轉化係統的開發應用，使愈來愈多的原來使用化學方法進行不對稱合成的化合物有可能被生物催化轉化的方法來替代［7～10］。利用生物轉化技術進行手性藥物的開發主要進行兩個方麵的工作：一是進行藥物關鍵中間體的製備，因為利用生物催化轉化方法製備對映體純化合物(enantiopure compounds)具有很大的吸引力，但試圖利用這種方法來完成所期望的複雜的有機合成往往是困難的，甚至是不可能的，而利用這種方法獲得某一關鍵中間體是切實可行的；另外，盡管用化學的方法能夠在實驗室條件下獲得所需要的手性藥物，但往往是由於成本和技術問題難以實現產業化。因此用化學生物化學的製備路線具有獨特的優越性，即所謂的“綠色合成工藝”；二是進行消旋化合物的生物拆分或轉化，得到單一構型的藥物分子。表1為一些利用生物轉化製備手性藥物或關鍵中間體的實例［11］。
3 組合生物催化與新藥發現組合
生物轉化(催化)(combinatorial biocatalysis)，是指利用一種以上的具有特殊轉化功能的微生物或酶，對同一個母體化合物進行組合轉化，以得到化學結構的多樣性，它是從已知化合物中尋找新型衍生物以及從簡單化合物製備複雜化合物的有效手段。從某種角度講，它比化學合成的方法更為簡單和有效。這是一個新的研究領域。天然產物的多樣性和其結構的複雜性，是存在於生物體內大量酶的作用結果。生物體內負責一係列重要生命活動的酶，在體外同樣具有相同的催化能力。因此，隻要體外的催化環境與體內相仿，則能夠實現一係列複雜的，特別是用傳統化學合成方法難以實現的化學反應。利用生物催化劑或化學合成酶催化相結合的方法，能夠大大地增加衍生物的多樣性，以及能夠有效地對複雜天然產物的結果修飾和從簡單的分子構建新的化合物庫，在這過程中，往往能夠發現新的生理活性物質。生物催化劑為擴大組合化學提供了各種合成的可能性［1，11～13］。表2為一些由酶或微生物催化的典型反應。利用生物催化發現先導化合物的優越性在於：1)可能進行反應的範圍廣；2)能夠定向進行區域選擇性和立體選擇性；3)不需基團保護和脫保護，一步實現所需的反應；4)在溫和和均一的條件下可容易地實現自動化和一步反應的重現性；5)溫和的反應條件保證了複雜易變的分子結構的穩定性；6)高的催化活性可以降低催化劑的用量；7)酶的固定化可以使催化劑反複和循環使用；8)生物催化劑可在環境中完全被降解。
4 近年來本中心開展的一些相關課題的進展
近年來，上海來益生物藥物研究開發中心開始涉及微生物轉化課題的研究，特別是用微生物進行植物甾醇邊鏈降解製備甾體藥物關鍵中間體的開發以及抗糖尿病新藥米格列醇和伏格列波糖的開發。
4.1 甾體類微生物轉化的研究甾體藥物包括激素類藥物和非激素類藥物：前者如性激素、類皮質激素和蛋白同化激素等；後者有抗細菌和抗腫瘤藥物等。由於其不可取代的用途及治療適應證不斷擴大，甾體藥物越來越引起人們的重視。利用生物轉化技術進行甾體藥物生產主要有植物甾醇的邊鏈切除，以得到關鍵中間體ADD和4AD，以及進行立體選擇性的羥化反應。(1)利用微生物轉化切除邊鏈，製備甾體藥物關鍵中間體ADD和4AD微生物對甾體邊鏈的裂解轉化是一個很慢的過程，因為底物和產物的溶解性都很差，且底物傳遞至細胞的過程和產物傳出細胞的過程都很慢。因此，如何提高底物的溶解性一直是提高微生物轉化率的重要步驟。我們在微生物轉化菌株的菌種選育、轉化條件的優化和轉化係統的研究方麵進行了數年的研究工作［14～17］，最終已經獲得了具有產業化價值的微生物轉化技術，即以天然維生素E生產下腳料(含有混合植物甾醇)為底物製備甾體藥物關鍵中間體ADD和4AD的工業化路線。圖1所示為混合植物甾醇底物和ADD以及4AD的化學結構。(2)利用微生物轉化選擇性羥基化，製備甾體藥物關鍵中間體11OHADD、11OH4AD，以及抗心衰新藥依普利酮關鍵中間體11OH坎利酮我們分別進行了以ADD、4AD以及坎利酮為底物的微生物轉化菌株的篩選、選育，以及轉化條件的優化等大量研究工作，最終獲得了具有產業化價值的微生物轉化製備工藝。圖2所示為11OHADD和11OH4AD的化學結構。圖3所示為從坎利酮到11OH坎利酮的微生物轉化。(3)利用微生物轉化技術，獲得多種4AD結構類似物很多甾體藥物的關鍵中間體與4AD的結構類似物有關，我們篩選了多種具有不同特性的微生物菌株對4AD進行轉化，結果得到了一係列的4AD結構類似物，如圖4所示［18］。(4)利用微生物轉化技術，從植物混合甾醇直接生產睾酮在我們多年對植物甾醇微生物轉化邊鏈切除的研究過程中，發現了一個非常有意義的現象：即在經過誘變處理的大量微生物轉化菌種中，發現了一株能夠直接將植物甾醇轉化成睾酮的菌株［19］。同時，轉化條件的改變能夠使睾酮的轉化率大大地提高。進一步的研究表明，能夠將植物甾醇直接轉化成大量睾酮的微生物菌株，其17羰基還原酶的活性比較高，因而將已經轉化的ADD和4AD中17位的羰基還原成為羥基，分別獲得睾酮和去氫睾酮，以及另外一個17位邊鏈發生改變的結構類似物，如圖5所示。經過大量的菌種選育工作和轉化條件的優化工作，已經獲得了一條利用微生物轉化直接從混合植物甾醇製備睾酮的工業化工藝路線。
4.2 降糖藥物米格列醇的研究開發米格列醇(miglitol)的發現源於對微生物發酵產物野尻黴素的研究，研究顯示該原來作為抗沙門氏菌的抗生素具有較強的α葡萄糖苷酶抑製作用，繼而成為第一個具有開發價值的澱粉酶抑製劑。1脫氧野尻黴素(1deoxynojirimycin)由野尻黴素還原而得，也可由多種鏈黴菌和芽孢杆菌產生，同樣具有糖苷酶抑製作用。N取代1脫氧野尻黴素具有更好的降糖效果，米格列醇就是其中之一。米格列醇的結構與葡萄糖相似，能夠可逆地競爭性抑製假單糖α葡糖苷酶，減少單糖的代謝，降低在小腸的吸收。圖6所示為葡萄糖、1脫氧野尻黴素和米格列醇的化學結構。根據文獻報道，有多種製備米格列醇的化學合成工藝。其中有以6脫氧6氨基山梨醇為原料，經雷尼鎳催化還原後，再與環氧乙烷反應而成。也可以先與環氧乙烷反應後，再在鈀碳催化下還原製得。另外，也有多種利用生物轉化和化學合成相結合的方法，以及先用微生物發酵製備野尻黴素或1脫氧野尻黴素後再用化學合成的方法來製備米格列醇［20］。本中心研究開發的米格列醇製備工藝采用生物轉化與化學合成相結合的方法，簡要工藝流程如圖7所示。本製備工藝的關鍵是篩選具有高效氧化氨基葡萄糖的微生物菌株，以及能夠實現產業化的轉化工藝。
4.3 降糖藥物伏格列波糖的研究開發伏格列波糖(voglibose)是新一代的α葡糖苷酶抑製劑，最初是從某種放線菌培養液中發現的氨基糖類似物，口服後能競爭拮抗性地抑製腸道內雙糖類水解酶(α葡糖苷酶)，延緩糖尿病患者餐後血糖的迅速上升從而抑製餐後高血糖。同時伏格列波糖明顯降低身體的脂肪量，肥胖的減輕使胰島素受體敏感性增加，進而使空腹血糖逐漸明顯下降。據文獻報道，伏格列波糖的製備除了通過全化學合成獲得外，還有以下幾條路線：一條路線是由有效黴素產生菌發酵，從發酵液中分離出大組分有效黴素A，經生物轉化後得到關鍵中間體valienamine和validamine，再經過化學合成即可得到終產物；或是從有效黴素發酵液中分離出小組分有效黴素G，生物轉化得到關鍵中間體valienamine和valiolamine，兩者經適當步驟的化學合成反應後即可得到終產物；第二條路線是從有效黴素發酵液中分離出小組分valienamine，經化學合成後得到終產物；第三條路線是從有效黴素發酵液中分離出小組分valiolone，同樣經適當化學合成反應後得到終產物；第四條路線是由D葡萄糖經一係列的化學反應直接合成得到終產物。其流程如圖8所示。本研究中心利用第一條工藝路線，篩選獲得了具有高轉化效率的微生物菌株，以及適合工業化生產的轉化工藝。
4.4 N乙酰神經氨酸的研究開發N乙酰神經氨酸(Neu5Ac)是合成抗病毒藥物紮那米韋的前體，其本身也具有多種重要的應用價值。目前有三種不同的生物轉化方法製備Neu5Ac(圖9)：途徑Ⅰ是一個相對簡單的醛縮反應；途徑Ⅱ涉及到反應前體ManNAc的磷酸化；途徑Ⅲ所合成的產物Neu5Ac9P需要進一步用另外的酶脫磷酸化。這些合成方法均可在體外進行，目前已經用於工業化生產的是途徑Ⅰ。
本中心采用途徑Ⅰ的生物轉化方法，首先從E.coliC600中成功地擴增了N乙酰神經氨酸裂合酶基因(nal)，通過同源性比較發現，它與來源於E.coli K12的nal序列完全一致。氨基酸序列比對結果表明，136和164位的氨基酸也為賴氨酸和酪氨酸，與文獻報道的活性中心位點一致。進而，將該基因通過EcoRI和BamHI兩個酶切位點，嚴格控製起始密碼子和啟動子間距離的情況下克隆到高表達載體pYG5上，構建成新的質粒pLY2，並進行其表達研究。然後對粗酶的製備、轉化條件的優化、分析檢測方法的建立，以及產物的分離純化等進行了研究， 初步獲得了一條適合工業化生產N乙酰神經氨酸的路線。
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