2培養基
改良馬丁瓊脂培養基:用於黑曲黴複蘇、複壯.
液體硫乙醇酸鹽培養基:用於生孢梭菌複蘇、複壯.
營養肉湯培養基:用於金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢杆菌、銅綠假單胞菌複蘇、複壯。
改良馬丁培養基:用於白色念珠菌複蘇、複壯.
3操作步驟：
a.打開潔淨工作台。
b.在安瓿的外表麵用75%的酒精擦拭並讓其自然風幹。
c.用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿掰開（開啟安瓿時必須小心，因為安瓿遇熱時可能會破裂）。
d.以無菌方法用一無菌吸管從已準備好的上述液體培養基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。
e.輕輕地旋轉安瓿以使凍幹菌種和液體培養基充分混合並完全溶解。
f.用無菌吸管將安瓿內菌液全部轉接到相應的液體培養基。
g.根據安瓿上所標明的不同菌種類型而將其培養於相應的溫度（細菌培養溫度30～35℃，培養18～24小時；真菌培養溫度23～28℃，培養3～5天。觀察是否渾濁，渾濁說明菌種複蘇生長；若不渾濁，細菌應延長培養時間至7天，真菌應延長培養時間至14天，若仍未渾濁，滅菌處理。
h.黑曲黴的菌懸液先室溫待菌懸液融化後用無菌吸管吸取管內液體1～2滴滴在改良馬丁瓊脂斜麵上，用吸管塗布均勻，置23～28℃培養5～7天，斜麵正麵為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應有雜色，斜麵側麵無色，接近菌層培養基略帶黃色。確認後用含有0.05%（ml/ml）的吐溫-80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫到無菌試管中。
i.取經複蘇後的上述細菌菌液8-10ml至液體培養基中按g項操作對菌種進行複壯。以無菌技術向複壯後的菌種中加入100ml20%的無菌甘油混勻，1-2ml/管分裝於凍存管。每個菌種製備10支，按順序進行編號，最後一支做為質控管進行質量控製，即進行相應的確認。其餘作為儲備管。黑曲黴的h項下洗脫液按h項下方法進行複壯，製成複壯後的孢子懸液20ml。以無菌技術向複壯後的菌種中加入20ml 、30%的無菌甘油混勻，1-2ml/管封存於凍存管。製備10支，按順序進行編號，最後一支做為質控管進行質量控製，即進行相應的確認。其餘作為儲備管。將上述製備好的凍存管逐支粘貼標簽。內容包括：菌種名稱、菌種代號、編號、代次、製備日期、製備人、貯存條件、有效期至等。
j．儲備菌種管製備成功，儲存於－20℃，有效期為三年。
4菌種確認
用無菌接種環從質控管中取細菌培養物接種到營養瓊脂培養基平板上，或相應的宜於該細菌生長的鑒別平板上，劃線分離出單個菌落。然後在30～35℃下培養2～3天；同樣的方法取真菌到玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板，並在23～28℃下培養7天；培養後，觀察其菌落形態，應符合該菌種形態特征。
5汙染處理
假如在該平板上發現有其他菌落生長，則說明或操作有汙染或菌種不純。將此被汙染了的培養物滅菌處理。可尋找原因重新分離挑選純菌落轉接斜麵菌種作為第四代。並重新製備儲備菌種管
6菌種的傳代與保藏
將菌種接種至一新鮮培養基上，每萌發一次即稱為一代，因此，當原始菌種複溶並轉至新培養基內生長，即認為已傳代一次，從菌種保藏中心獲得的冷凍幹燥的菌種為第0代，冷凍幹燥的原始菌種開啟後轉種後為第1代，直到第3代為工作菌種。菌種的傳代次數（自原始菌種凍幹粉起）不得超過5代。
菌種的傳代保藏過程
3項下標準菌的複蘇為傳第一代，複壯為第二代。 傳第三代時取1支凍存管自然解凍，將其轉接斜麵菌種作為工作用菌種。此時，工作用菌種為第3代。工作用菌種，分為兩類：一類用於定期傳代(W3)，一類用於實驗用（S3）。
定期傳代用菌的傳代其操作步驟如下（斜麵接種法）：
（1）從冰箱冷藏室中取出菌種斜麵後，應在室溫放置約30分鍾。
（2）將裝有新鮮配製的培養基菌種保藏管管壁上注明菌名及接種日期，和傳代菌種一並移入潔淨工作台，打開紫外燈照射一小時。
（3）關閉紫外燈。點燃酒精燈，左手握住菌種斜麵，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒後端，將接種環燒紅約30秒，隨後將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過三次。
（4）右手用無名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉燒灼，右手再輕輕拔開管塞，將接種環伸入管內先在近壁的瓊脂斜麵上靠一下，稍冷後再至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒並將菌種管口移至火焰上方。
（5）塞上管塞，左手將菌種管放下，取營養瓊脂斜麵（或改良馬丁瓊脂斜麵）一支，照上述操作打開管塞，將接種環伸入管內至瓊脂斜麵的底部向上劃一條直線，然後從底部向上作連續曲線劃線，一直劃到斜麵頂端，使細菌接種在斜麵的表麵上。
（6）取出接種環，在火焰上方將培養基管蓋上塞子，然後將接種過細菌的接種環在火焰上燒灼滅菌。
（7）將已接種好的細菌管置30～35℃細菌培養箱培養22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培養箱最多培養7天。
當工作用菌種傳代代數小於5時，可直接用上一代工作用菌種轉接下一代工作用菌種，如：（W3）可直接轉接為（W4）。按上述程序操作，直至（W4）轉為（W5）為止，需重新接種，舊的工作菌種進行銷毀。
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