實驗室診斷主要包括以檢測致病菌及其抗原、產物或核酸為目的的細菌學診斷，以及檢測患者血清中特異性抗體為目的的血清學診斷。
一、細菌學診斷
（一）標本采集
細菌感染性疾病的實驗室檢查結果主要取決於臨床標本的質量、采集時間及方法、實驗人員的技術熟練程度及經驗。臨床醫生應該知道何時和怎樣采取標本，需作哪些實驗室檢查，以及如何解釋結果。為提高致病菌檢出率，避免診斷錯誤或漏檢，標本采集與送檢過程應遵循下列原則：
1．嚴格執行無菌操作，盡量避免患者正常菌群或外界環境中雜菌汙染標本。采取局部病變標本處，不可用消毒劑，必要時宜以無菌生理鹽水衝洗，拭幹後再取材。從呼吸道、消化道、泌尿生殖道、傷口或體表分離可疑致病菌時，應與其特定部位的正常菌群及臨床表現一並加以考慮，因為目前內源性感染呈不斷上升趨勢。
2．根據致病菌在患者不同病期的體內分布和排出部位，采集不同的標本（表7-1）。例如流行性腦膜炎患者取腦脊液、血液或出血瘀斑；傷寒患者在病程第1～2周內取血液，第2～3周時可取糞便。盡可能采集病變明顯部位的材料。
3．應在疾病早期和使用抗菌藥物之前采集標本，否則可能需停藥數天後采集，或者在分離培養時加入藥物拮抗劑。
4．標本必須新鮮，采集後盡快送檢，尤其是檢測抵抗力弱的細菌。若不能立即送檢，應將標本置於特殊的轉運培養基中，低溫保存，以減緩致病菌的死亡，阻止雜菌的過度生長。送檢過程中，除不耐寒冷的腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等要保溫外，多數菌可冷藏送運。
（二）致病菌的檢驗程序
主要有直接塗片染色鏡檢、分離培養、生化試驗、血清學試驗等，有的尚需作動物試驗等。細菌學快速診斷新技術主要有核酸雜交（nucleic acid hybridization）和聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）等。敏感性、特異性和檢測效率是影響臨床診斷程序選擇的重要因素。
1．直接塗片染色鏡檢 直接塗片染色鏡檢法可在顯微鏡下直接觀察致病菌的形態、大小、排列方式和染色特點。凡在形態和染色性上具有特征的致病菌，直接塗片染色後鏡檢有助於初步診斷。例如痰中查見抗酸性細長杆菌，腦脊液或淤血點中查到腎形成雙排列的革蘭陰性球菌，膿液中發現革蘭陽性葡萄串狀球菌，或咽喉假膜中有異染顆粒的棒狀杆菌時，可分別初步診斷為結核分枝杆菌、腦膜炎奈瑟菌、葡萄球菌或白喉棒狀杆菌。此外，尿沉渣中發現優勢菌類，或長期腹瀉患者糞便中發現革蘭陽性球菌和真菌等優勢菌，均有重要的診斷價值。在某些情況下，也可在直接塗片後，以特異性熒光抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察，若出現有發熒光的菌體就是欲檢驗的細菌。例如糞便中的誌賀菌、霍亂弧菌，以及呼吸道標本中的嗜肺軍團菌和百日咳鮑特菌等可用此技術快速檢出。
染色或不染色標本的形態學檢查法較為簡便、快速、價廉，為臨床檢驗所常用，特別是有的細菌尚不易進行人工培養，或培養時周期較長，隻能通過直接塗片染色並結合臨床確診。但是，直接塗片鏡檢法的敏感性不及分離培養法。
2．分離培養 有很多種類的細菌在形態、排列方式和染色性上不能區分，需進行細菌的分離培養，這是確診細菌感染性疾病最可靠的方法（金標準），並有助於選用抗菌藥物及評價療效。由於各種細菌的生物學特性有所差異，所采用的培養基和培養方法也不盡相同。
從無菌部位采取的血液、腦脊液等標本，可直接接種至營養豐富的液體或固體培養基；從正常菌群存在部位采取的標本，應接種至選擇或鑒別培養基。接種後置37℃孵育，一般需氧菌經16～20小時大多可形成菌落（colony），厭氧菌和微需氧菌通常需2～3天才形成菌落。少數菌如布氏菌、結核分枝杆菌生長緩慢，分別需培養3～4周和4～8周才長成可見菌落。根據細菌所需要的營養、生長條件、菌落特征可作初步鑒別，確診還需對純培養物進行形態特征、生化試驗和血清學試驗鑒定。分離培養法的陽性率要比直接塗片鏡檢高，但需時較久。因此，遇白喉、氣性壞疽等急性傳染病時，可根據患者臨床表現和直接塗片鏡檢結果作出初步診斷並及時治療，不必等待分離培養報告，以免貽誤治療時間。
3．生化試驗 細菌的代謝活動依靠一係列酶的催化作用。不同細菌具有不同的酶係，對營養物質的分解能力及其代謝產物不盡相同。檢測細菌對各種基質（如糖類和蛋白質）的代謝作用和代謝產物的差異，借以區別和鑒定細菌，稱之為細菌的生化試驗（biochemical testing）。例如幽門螺杆菌產生極強的尿素酶，可分解尿素產生氨，使培養液呈堿性，pH指示劑則改變顏色。生化試驗對菌體形態、革蘭染色反應和菌落特征相同或相似的細菌（如腸道杆菌）的鑒定尤為重要。
現代臨床細菌學已普遍采用微量、快速、半自動化或自動化的細菌生化鑒定和細菌藥敏分析係統，使細菌檢出水平明顯提高，所需時間大為縮短，推進了相關標本鑒定的準確性與時效性。其中，VITEK-AMS係統可鑒定細菌和真菌200～300多種及近100種不同抗菌藥物的敏感性測試。細菌鑒定原理是根據不同細菌的理化性質不同，采用光電比色法，測定細菌分解底物導致pH改變而產生的不同顏色，來判斷反應的結果。
4．血清學試驗 在許多情況下，難以從患者的臨床標本中分離出致病菌，特別是在發病早期已用抗生素等藥物治療過的患者，因致病菌的生長被抑製或殺死，可明顯影響致病菌的檢出率。但是，采用血清學試驗（serological testing），即用含有已知的特異性抗體的免疫血清，可快速、準確地檢出臨床標本中極微量的致病菌特異抗原，亦可鑒定分離培養出的未知純種細菌，並可確定致病菌的種或型，有助於確定病因。常用方法有凝集試驗（如玻片凝集試驗、協同凝集試驗、乳膠凝集試驗、反向間接血凝試驗）、免疫熒光技術、酶聯免疫吸附（ELISA）等。
5．動物試驗 利用動物實驗，可進行致病菌的分離與鑒定、細菌毒力的檢測等。常用實驗動物有小鼠、豚鼠和家兔等。應根據實驗目的，選用一定體重或年齡的高度易感性的健康動物。接種途徑有注射（皮內、皮下、腹腔、肌肉、靜脈、腦內）和灌胃等。接種後應仔細觀察動物的食量、精神狀態和局部變化等。若動物出現特有的症狀或死亡，應立即解剖，檢查病變，或作細菌分離培養，證實由何種致病菌所致。動物實驗一般不作為常規細菌學診斷。
6．基因診斷技術 核酸雜交和PCR技術不需分離培養，隻需檢測標本中致病菌的特異性核酸片段，即可鑒定出致病菌，具有特異性強、敏感度高、快速等特點，尤其適用於檢測難以或不能培養的致病菌（如梅毒螺旋體），以及培養時間較長或培養條件苛刻的致病菌（如立克次體、衣原體、結核分枝杆菌、幽門螺杆菌、空腸彎曲菌、嗜肺軍團菌和無芽胞厭氧菌等）。
（1）核酸雜交技術：原理是應用放射性核素或生物素、地高辛、辣根過氧化物酶、熒光素等非放射性物質標記的已知序列單鏈核酸（如16SrRNA編碼基因中的保守序列）作為探針（probe），在一定條件下，根據堿基配對原則，與待測標本的同源或部分同源核酸單鏈退火，形成雙鏈雜交體。然後，通過雜交信號的檢測，鑒定臨床標本（如血清、尿、糞便或活檢組織）中有無相應的病原體特異基因。
核酸雜交過程可在溶液中進行（液相雜交），也可使探針DNA結合到固相載體（如硝酸纖維膜）上，或使組織中DNA雙鏈打開，然後進行雜交（固相雜交）。固相核酸雜交較為常用，有原位雜交（in situ hybridization）、斑點雜交（dot blot）、Southern印跡、Northern印跡等。核酸雜交可直接檢出標本中的致病菌，不受標本中的雜質幹擾，對尚不能或難分離培養的致病菌尤為適用，亦可同時檢出多種致病菌。
（2）PCR技術：是一種體外擴增特異性DNA片段的技術，具有快速、靈敏度高和特異性強等特點。其基本步驟是，從標本中提取DNA作為擴增模板，選用一對人工合成的特異寡核苷酸作為引物，在熱穩定DNA聚合酶作用下，經不同溫度的變性、退火、延伸，多次循環後，即可在數小時內獲得數百萬個特異性DNA序列的拷貝。擴增產物作瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色後，即可確定要擴增的目的DNA存在與否。若需進一步鑒定，可從凝膠中分離和回收PCR產物，再用標記的特異探針確定，或直接測序分析。目前，PCR技術和由此發展而來的逆轉錄PCR（reverse transcriptase PCR, RT-PCR）、定量實時熒光PCR（real-time PCR）等技術已廣泛用於感染性疾病的基因診斷。
（3）DNA芯片（DNA array）技術：又稱基因芯片（gene chip）技術，由核酸雜交技術衍生而來。其基本原理是：首先，將大量的特異寡核苷酸探針有序地、高密度地點布並固定在矽片、玻片等固相支持物上，組成DNA微點陣（microarray），即DNA芯片；然後，抽提待檢樣本中的DNA或mRNA，用熒光染料標記後，與DNA芯片上的探針雜交，應用激光共聚焦顯微掃描技術，記錄雜交結果；最後，應用分析軟件，對雜交位點及其信號強弱進行分析，找出差異表達的基因，判別標本中的特異性致病菌。應用致病菌基因組、耐藥基因、毒力基因等重要基因的芯片，通過單一雜交即可完成致病菌的基因分型與菌種鑒定、耐藥性快速診斷、致病菌與非致病菌鑒定等，為臨床治療提供可靠的理論依據。該技術可將許多不同類型的探針同時固定於一張芯片上，一次可對樣品中可能存在的多種致病菌進行係統檢測分析。
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