向日葵菌核病拮抗菌 XRK5 的篩選與鑒定

摘   要:  從向日葵根際分離了640個細菌分離物,以向日葵菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)為靶標菌, 通過平板對峙法獲得了18個具有拮抗性能的細菌,其中 XRK5 具有較強拮抗能力,且拮抗性能穩定,具有較好的生防應用潛力。經過形態觀察、生理生化特征及16S rRNA 序列分析,將XRK5 鑒定為辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici), XRK5 的 16S rRNA 序列在 GenBank 中的注冊號為FJ959348。

關鍵詞: 向日葵菌核病,拮抗細菌,鑒定

菌核病是一種世界性真菌病害,其病原菌——核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)以菌核的形式在土壤中越冬越夏,當溫度及濕度條件適宜時,菌核萌發產生子囊盤,散發的子囊孢子侵染植物,可寄生450 多種植物。在我國的東北、內蒙古、山西、西北等地向日葵菌核病危害嚴重。向日葵感染菌核病菌後,產量下降,皮殼率增加,籽仁蛋白質及油率下降,發病後子粒失去了實用價值和商業價值,  極大地影響了向日葵種植業的發展。

向日葵菌核病當前的主要防治措施是化學防治,但其效果不理想、防治成本高、還造成環境汙染。由於核盤菌寄主範圍廣泛,病菌以菌核形式長期存活於土壤中,當條件(溫、濕)適宜時菌核萌發產生子囊盤,散發的子囊孢子由氣流傳播構成初侵染源,這種流行特點給菌核病的控製帶來了極大的困難 。對菌核存活的生物學研究表明,土壤中的生物因子是影響菌核存活的主要因子,另外,生物防治的方法還可以減少化學農藥帶來的環境汙染,因此利用某些生物因子防治菌核病值得深入研究。有關向日葵菌核病生防方麵的報道甚少,目前已報道的具有一定生防應用潛力的菌核寄生菌隻有盾殼黴(Coniothyrium minitans),木黴 (Trichoderma spp.),粘帚黴(Glioclaclium spp.),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 等少數菌種。

本實驗從向日葵根際篩選出一株對核盤菌有高效和穩定拮抗能力的細菌,  具有較好的生防應用潛力,命名為XRK5,並被鑒定為辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici)。

1   材料和方法

1.1  材料

供試病原菌: 向日葵菌核病菌(Sclerotinia scle-rotiorum)由本實驗室保存。

培養基: 馬鈴薯蔗糖培養基(PSA),牛肉膏蛋白腖培養基(NA),高氏一號培養基, LB 培養基。

試劑:  分子生物學試劑和 3S 柱離心式瓊脂糖DNA 小量快速純化試劑盒(3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit)購於上海申能博彩生物科技有限公司。

土壤樣品:  從內蒙古巴彥淖爾盟烏拉前旗采集的 6 份向日葵根際土樣。

1.2    拮抗菌的分離與篩選

采用樣品梯度稀釋法得到分離物:準確稱取向日葵根際土樣 10 g放入裝有 90 mL無菌水並放有玻璃珠的三角瓶中,振蕩 20 min後靜置 20-30s,即得10^-1稀釋液,然後利用梯度法分別稀釋成 10^-2 到10^-9的稀釋液。各取 0.1 mL 的稀釋液(10^-5 、10^-6 、10^-7、 10^-8 )分別塗布於 LB 和 PSA 培養基上,  各取0.1 mL 稀釋液(10^-3 、10^-4 、10^-5 、10^-6 )塗布於高氏一號培養基上。LB 培養基 37℃ 培養, PSA 和高氏一號培養基 28℃培養, 待其長出分離物。

采用平板對峙法篩選拮抗菌:將馬鈴薯蔗糖培養基倒平板,用滅菌解剖刀將活化好的病原真菌切成邊長約為 1cm 的正方形狀,置於平板中央,於28℃ 培養 2-3 d,待病原真菌長到直徑為 2cm 時,用接種環挑取分離物,從靠近病原真菌的一側沿與其生長方向相交的方向劃線接種,每個培養皿接種6-8個試驗菌,於28℃培養24-48h,  根據有無抑菌帶及抑菌帶的大小判斷其拮抗效果。

1.3  XRK5 的鑒定

形態特征和生理生化特征的測定方法參閱文獻 。

1.4  PCR 擴增 16S rRNA 序列

以細菌總 DNA 為模板, 27F (5′-GAGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′)和 1495R (5′-CTACGGCTA CCTTGTTACGA-3′) XRK5 16S rRNA作引物擴增 的PCR : 95℃ 5 min; 94℃ 1 min, 序列。 反應條件為56℃ 1 min, 72℃1.5 min, 30 個循環; 72℃10 min。用 3S  柱離心式瓊脂糖 DNA 小量快速純化試劑盒(3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit)純化 PCR 產物。

1.5  16S rRNA 序列測定及分析

測序由上betway必威西汉姆联尚生物技術有限公司完成。測序結果用NCBI  數據庫中的BLAST 進行相似性分析,采用MEGA 4.0程序的Neighbor-joining算法構建係統發育樹。

2   結果與分析

2.1   拮抗細菌的篩選

從 6 份向日葵根際土樣中得到 640 個細菌分離物,  經過初篩、複篩獲得 3 株具有良好拮抗作用的細菌分離物,其中一株命名為 XRK5,  其抑菌圈直徑可達 10 mm-15 mm (見圖 1),  經多次實驗驗證其抑菌效果較為穩定。

2.2  XRK5 的形態學特征

XRK5 的菌體大小為(0.8-0.9)μm×(3.5- 5.0)μm,  其最大生長長度可達 50 μm以上(如圖 2所示),  革蘭氏染色陰性,兼性厭氧,長杆狀,在 LB平板上生長 24 h 後,菌落為奶油色,粘稠厚重,不透明,表麵濕潤光滑,邊緣規則。

2.3  XRK5 的生理生化特征

根據已報道的幾類溶杆菌的生理生化特征進行實驗 ,結果顯示, XRK5 與已報道的 L. capsici YC5194和L. capsici KCTC22007的生理生化特征相同,比如:  不能氧化分解葡萄糖,能產生胰蛋白酶,也能產生α-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶,可以水解七葉苷, 不能水解馬尿酸鹽,不能以麥芽糖為碳源,檸檬酸鹽實驗呈陽性,不產生 β-半乳糖苷酶等。

XRK5 的生理生化特征如表 1 所示。

表1 生理生化特征

注：+：陽；-：陰；ND：未測定

2.4    16S rRNA 序列分析

用引物 27F 和 1495R PCR 擴增 XRK5 的16S rRNA 序列, PCR  產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳, 凝膠成像如圖 3 所示。 經測序分析 XRK5擴增的16S rRNA  序列長為1400 bp, 將得到的序列提交 GenBank 獲得注冊號FJ959348。將 XRK5的16S rRNA 序列進行 BLAST分析,結果顯示, XRK5與 Lysobacter capsici  55 (FN357198)的相似性最高,達到了100%,與 L. an-tibiotics HS124 (FJ930928)的相似達到了99%。

將 XRK5 的 16S rRNA 序列在 NCBI 數據庫中進行 BLAST 分析後,構建係統發育進化樹。如圖 4 所示, XRK5 與 L. capsici 55 和 L. antibiotics HS 124 處於最小分支。我們根據 XRK5 的16S rRNA 分析,結合其生理生化特征,將 XRK5鑒定為 L. capsici。

3   討論

利用拮抗菌防治向日葵菌核病是生物防治的重要手段之一,並且此方法具有不汙染環境,不產生抗性,僅殺傷或抑製防治對象,能參與生態環境的調控，保持生態平衡能起到長效作用等優點。因此,篩選更多具有高效、穩定拮抗能力的拮抗菌對菌核病的防治具有十分重要的意義。

本實驗從向日葵根際土壤篩選到了一株具有較好應用潛力的拮抗菌菌種資源 Lysobacter capsici  XRK5, 經過多次拮抗實驗證明此株菌均表現出穩定的拮抗性。Lysobacter capsici 為 2008 年發現的新種,其對向日葵菌核病的防治國內外均未見報道。本實驗對 XRK5 的分類鑒定和拮抗效果進行了初步的研究,  其拮抗物質鑒定和拮抗機理的研究尚需進一步的實驗證明。本研究結果為構建高效的基因工程菌和研製向日葵菌核病生防製劑奠定了良好的基礎。

作者：侯啟會  杜秉海  靳奉理  王雪  張浩文  丁延芹  姚良同 

(山東農業大學生命科學學院  農業微生物重點實驗室   山東  泰安  271018)

參考文獻（略）

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