2.3 抗生素的平板抑菌實驗結果
將萬古黴素、頭孢噻吩、紅黴素分別以不同的濃度添加到基礎培養基(腦心瓊脂)中，接種定量菌液，觀察抑菌效果，以確定最終的抗生素組合和添加濃度。結果表明，萬古黴素、頭孢噻吩適合使用於阪崎腸杆菌選擇性培養，與定量抑菌實驗結果一致；而紅黴素與定量抑菌濃度實驗結果不一致，不適合使用於阪崎腸杆菌選擇性培養。
將萬古黴素(4ug／mL)和頭孢噻吩(0.1ug／mL)兩種抗生素組合添加到基礎培養基中，製備成抗生素選擇培養基，阪崎腸杆菌能生長， 10株非阪崎腸杆菌中的9株(大腸杆菌、沙氏菌、誌賀氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、陰溝腸杆菌、普通變形杆菌、奇異變形杆菌)均被抑製，沒有生長，隻有產氣腸杆菌能生長。表明在基礎培養基中添加兩種抗生素明顯起到了抑製大部分雜菌的效果，結果見圖1。從網中可看出，萬古黴素和頭孢噻吩兩者的抗菌譜有交叉、也能互相補充，兩者結合使用於阪崎腸杆菌選擇性培養基中，具有除阪崎腸杆菌外比單一抗生素更廣泛的抑菌譜。
2．4 Vc選擇性顯色培養基對不同細菌的生長效果
盡管在基礎培養基中添加了抗生素組合後，抑製了絕大部分雜菌，但不可避免地仍有少量雜菌生長。為進一步增強培養基的特異性，在培養基中添加了顯色劑(5-溴-4氯-3-吲哚-a-葡萄糖苷，0.1ug／L)，阪崎腸杆菌能分解顯色劑，呈藍綠色，從而與其他雜菌區分開。
為驗證V 選擇性顯色培養基(基礎培養基+抗生素組合+顯色劑)是否適合阪崎腸杆菌的生長，取不同阪崎腸杆菌濃度的10u L菌液(菌量分別為1000、1O0、10、1cfu／mL)塗布到平板培養24h，四個接種部位都有菌生長，菌落呈藍綠色，說明該培養基完全不會抑製阪崎腸杆菌的生長，結果見圖2。同時，取10uL 非阪崎腸杆菌菌液(菌量約10000cfu／mL)塗布到平板培養24h，除產氣腸杆菌有生長外，其他9株非阪崎腸杆菌均未生長。產氣腸杆菌雖有生長，但菌落呈土黃色，與阪崎腸杆菌菌落容易區分。
2.5 Vc選擇性顯色培養基檢測實際樣品的檢出限
為測定Vc選擇性顯色培養基對實際樣品的檢出限，人工定量汙染阪崎腸杆菌到奶粉樣品，用Vc選擇性顯色培養基和SN／T 1632．1—2005 中的VRBGA平板進行對照檢測。檢測結果表明，VRBGA平板上有雜菌生長，而Vc選擇性顯色培養基成功抑製了雜菌，增強了特異性。Vc選擇性顯色培養基檢出限達到1cfu，顯示了良好的靈敏性。
3 討論
最早用於分離阪崎腸杆菌的培養基是美國FDA推薦的VRBGA，該菌在VRBGA 平板上可長成兩種菌落，一種是典型的光滑型菌落，容易被接種環移動；另一種是幹燥型或黏液狀菌落，但大部分生長成黏液狀、周邊有膽汁酸沉澱的紅色菌落。但部分其他腸杆菌科細菌在VRBGA上也能形成紅色菌落，不容易區分。
阪崎腸杆菌都有α-D-葡萄糖苷酶活性，利用這一特點，在基礎培養基中加入5-溴-4氯-3-吲哚-a-葡萄糖苷，可製成顯色選擇培養基 。阪崎腸杆菌在顯色培養基上呈藍綠色菌落，但其他一些細菌在顯色培養基上也能產生顏色，如金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、無害李斯特氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌呈藍色或藍紫色，肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種菌落中心呈藍綠色，泛菌屬的菌落與阪崎腸杆菌幾乎不能區分。另據報道，傷口埃希氏菌、克氏檸檬酸杆菌在顯色培養基上產生藍綠色菌落，非脫羧勒克氏菌菌落中心呈藍色，可見單靠顯色劑並不能達到區分阪崎腸杆菌和雜菌的目的。
設計選擇性培養基的另一種常用方法是在基礎培養基中添加合適的抑菌劑抑製雜菌生長，從而有利於目標菌的分離培養。在設計阪崎腸杆菌培養基時，Iversen 添加了脫氧膽酸鈉；Oh添加了3號膽鹽；趙貴明 添加了月桂基硫酸鈉。但這些抑菌劑主要是抑製革蘭氏陽性菌，對革蘭氏陰性菌效果不大，且不具有特別針對性，所以製備成的培養基抑製雜菌效果並不理想。本研究結合藥敏實驗及抑菌實驗，找到合適的抗生素組合(萬古黴素+頭孢噻吩)及濃度，既能抑製大部分雜菌，又不影響阪崎腸杆菌生長。萬古黴素主要是抑製革蘭氏陽性菌，頭孢噻
吩是廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有一定效果，但阪崎腸杆菌對其耐藥。因此選擇這兩種抗生素進行組合，起到了很好的抑製雜菌作用。但仍然有少數雜菌(如產氣腸杆菌)無法抑製，因此在培養基中添加顯色劑，進一步增強選擇性。
此外，用VRBGA 平板來分離阪崎腸杆菌，該培養基含有酵母粉、蛋白腖、葡萄糖等成分，營養非常豐富，阪崎腸杆菌在該培養基上瘋狂生長成片狀，常掩蓋了雜菌的存在，不利於叮疑菌落的分離，易導致下一步鑒定的失敗。而本研究建立的Vc選擇性顯色培養基，營養適中，且包含適當濃度的抗生素，能抑製阪崎腸杆菌的過度生長，但不影響其檢出水平，菌落大小適度，菌落形態規則，菌落之問有明顯間隙，便於挑選，見圖3。結合抗生素和顯色劑，製備成阪崎腸杆菌選擇性培養基。經模擬樣品檢測，表明該培養基能檢測到1cfu，具有良好的檢測限。本研究建立的培養基可應用於奶粉及相關產品中阪崎腸杆菌的檢驗。
作者：楊萬穎，祝仁發，李傳禮，賴心田，楊國武
作者單位：深圳市計量質量檢測研究院，廣東深圳518131
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