摘 要：目的：篩選一種新型、特異性高的阪崎腸杆菌選擇性培養基。方法：通過藥敏實驗，篩選出對阪崎腸杆菌耐藥而對其他雜菌敏感的抗生素；利用抑菌濃度實驗、抗生素組合平板實驗，篩選出最佳的抗生素組合方式及濃度。將抗生素組合與顯色劑添加到基礎培養基中，配製成阪崎腸杆菌的新型選擇培養基。結果：組合抗生素(4ug/mL萬古黴素、0.1ug／mL頭孢噻吩)和顯色劑(0.1g／L 5-溴-4氯-3-吲哚-a-葡萄糖苷)添加到腦心培養基中，製成阪崎腸杆菌Vc 選擇性顯色培養基，能最大限度地抑製雜菌生長，而對阪崎腸杆菌的生長沒有影響。經靈敏性實驗，對接種的奶粉樣品中的阪崎腸杆菌的檢出限達到1 cfu。結論：製得的新型阪崎腸杆菌選擇性培養基特異性強、靈敏度高，可用於奶粉樣品的分離檢測。
關鍵詞：阪崎腸杆菌，檢測，培養基
阪崎腸杆菌為革蘭氏陰性無芽孢杆菌，有周生鞭毛，能運動。嬰幼兒常因食用了汙染阪崎腸杆菌的奶粉而引起感染，臨床表現為腦膜炎、敗血症、壞死性結腸炎等症狀，死亡率較高，因此受到食品主管部門和奶粉生產企業的高度重視。目前，分離阪崎腸杆菌常用培養基為結晶紫中性紅葡萄糖膽鹽瓊脂(VRBGA)和顯色培養基。但由於其選擇性較差，實際使用時分離效果不理想，給檢測工作帶來極大的困難。本實驗擬通過大量的阪崎腸杆菌和非阪崎腸杆菌藥敏實驗，尋找合適的抑菌劑，添加到基礎培養基中，並結合顯色劑，研製出新的阪崎腸杆菌選擇性分離培養基，可大大地提高培養基的選擇性。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
阪崎腸杆菌標準株(45001) 購自中國藥品生物製品檢定所；23株野生株阪崎腸杆菌由本實驗室在檢測樣品中分離；非阪崎腸杆菌(大腸杆菌、沙門氏菌、誌賀氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、產氣腸杆菌、陰溝腸杆菌、普通變形杆菌、奇異變形杆菌共1O株)購自中國藥品生物製品檢定所或由本實驗室保存；腦心瓊脂購自北京陸橋生物技術有限公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；抗生素購自Amresco公司；API20E生化試劑條購自生物梅裏埃公司。
1.2 實驗方法
l.2.1 藥敏實驗對實驗菌株進行82種抗生素的藥敏實驗，方法參照WS／T 125—1999《紙片法抗菌藥物敏感實驗標準》。
l.2.2 抗生素定量抑菌濃度實驗從營養瓊脂上取新鮮菌落，用2倍濃縮肉湯調節細菌濃度到l麥氏單位；在細胞培養板上用無菌水將適當濃度的抗生素由初始濃度依次稀釋至2-1、2-2、2-3、2-4、2-5。各稀釋梯度分別加入與抗生素等體積的2倍濃縮肉湯菌液，相當於將抗生素再次稀釋了一倍，菌液濃度相當於0.5麥氏單位；同時設置空白對照(2倍濃縮肉湯+無菌水)和細菌生長對照(2倍濃縮肉湯菌液+無菌水)；37℃培養l8h，用酶標儀在63Onm 處測定菌液0D值。
2 結果與分析
2．1 藥敏實驗結果
本實驗旨在篩選出對阪崎腸杆菌耐藥而對其他非阪崎腸杆菌敏感的抗生素，以添加到基礎培養基中，來抑製雜菌生長。利用本實驗室從奶粉中分離得到的23株野生型阪崎腸杆菌菌株，通過牛化實驗分成7個生化。生化型的不同反映了菌株之間基因上的差異，而菌株的耐藥性也與基因有關。因此，本實驗在7種生化型中各取l株作為代表株，進行下一步的藥敏實驗。
用7種生化型的阪崎腸杆菌對82種抗生索進行藥敏紙片實驗。結果表明，青黴素G、苯唑青黴素、紅黴素、克拉黴素、羅紅黴素、新生黴素、乙酰螺旋黴索、柱晶白黴索、林可黴素、萬古黴素、麥迪黴素、氟潔黴素、兩性黴素、製黴菌素、滅滴靈、替考拉寧、氟康唑、依康唑、多粘菌素B、頭孢噻吩等20種抗生素對阪崎腸杆菌不敏感。
選取10株非阪崎腸杆菌進行上述20種抗生素的藥敏實驗，這10株非阪崎腸杆菌具有廣泛的代表性，用之所篩選出的抗生素能對絕大多數雜菌有抑製效果。結果表明，青黴素G、紅黴素、萬古黴素、多粘菌素B、利福平、頭孢噻吩6種抗生素對阪崎腸杆菌耐藥，而對部分非阪崎腸杆菌敏感。
2.2 定量抑菌濃度實驗結果
為了尋找出抑菌劑準確的作用劑量，以應用於選擇性培養基中，選取對阪崎腸杆菌耐藥而對非阪崎腸杆菌敏感的6種抗生素進行抑菌濃度實驗。
結果顯示，萬古黴索濃度在4ug／mL時，對金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、誌賀氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌有明顯的抑菌效果，而對阪崎腸杆茼尤抑製表現，表明可以用於Vc、選擇性顯色培養基。頭孢噻吩對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、陰溝腸杆菌、普通變形杆菌、奇異變形杆菌都有明顯抑菌效果，但在高濃度(16ug／mL以上)時，對阪崎腸杆菌也有抑菌效果，提示可選用其低濃度(1ug／mL及以下)用於Vc選擇性顯色培養基。紅黴素在lug／mL時，顯示對所有非阪崎都有一定的抑菌效果，但抑菌效力不高，提示可加大濃度用於Vc選擇性顯色培養基。利福平、多粘菌素B、青黴素G則即使在高濃度時也對非阪崎腸杆菌的抑菌效力不明顯。因此選擇萬古黴素、頭孢噻吩、紅黴素3種抗生素，以檢測其在培養基中不同的濃度對阪崎腸杆菌與非阪崎腸杆菌的實際生長抑製情況。
