2 結果與討論
2.1 影響0．intermedium DN2生長的關鍵因素
利用JMP軟件對 Plackett-Burman試驗結果進行方差分析。結果表明，影響菌株 DN2生長的顯著因素 (α=0.05)為：胰蛋白腖(P=0.004)、MgSO4·7H2O(P=0.033)、溫度(P=0.008)、裝液量(P=0.030)和培養時間(P=0．004)。本次實驗 pH值取值在最佳的水平範圍內，統計分析並未將此作為顯著因子。但 pH值是影響細菌生長的重要因素，因此下一步實驗也將予以考慮。菌株DN2是好氧菌，裝液量和轉速均影響其生長。但是本次試驗裝液量和轉速的 P值分別為0.030和0.086，說明裝液量對 DN2生長的影響比轉速大。而本次試驗選取α在0.05水平上的影響因子，故下一步試驗不考慮轉速。
2．2 響應麵優化DN2生長培養基
在對 Plackett-Burman試驗結果分析的基礎上，采用CCRD設計對影響DN2生長的關鍵內在因素胰蛋白腖、MgSO4·7H2O以及初始pH值進行了20組試驗，結果見表 2。
表2 旋轉中心組合設計及其實驗結果
|
實驗編號 |
X1(蛋白腖) |
X2(MgSO4.7H2O) |
X3(初始pH值) |
菌體濃度（lg cfu/ml） | |
|
實測值 |
預測值 | ||||
|
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
8.741 |
8.723 |
|
2 |
1 |
-1 |
-1 |
8.858 |
8.831 |
|
3 |
-1 |
1 |
-1 |
8.800 |
8.765 |
|
4 |
1 |
1 |
-1 |
8.720 |
8.724 |
|
5 |
-1 |
-1 |
1 |
8.646 |
8.642 |
|
6 |
- |
-1 |
1 |
8.879 |
8.915 |
|
7 |
-1 |
1 |
1 |
8.582 |
8.609 |
|
8 |
1 |
1 |
1 |
8.715 |
8.734 |
|
9 |
-1.682 |
0 |
0 |
8.678 |
8.696 |
|
10 |
1.682 |
0 |
0 |
8.911 |
8.892 |
|
11 |
0 |
-1.682 |
0 |
8.747 |
8.755 |
|
12 |
0 |
1.682 |
0 |
8.646 |
8.637 |
|
13 |
0 |
0 |
-1.682 |
8.789 |
8.834 |
|
14 |
0 |
0 |
1.682 |
8.821 |
8.775 |
|
15 |
0 |
0 |
0 |
9.123 |
9.126 |
|
16 |
0 |
0 |
0 |
9.102 |
9.126 |
|
17 |
0 |
0 |
0 |
9.144 |
9.126 |
|
18 |
0 |
0 |
0 |
9.155 |
9.126 |
|
19 |
0 |
0 |
0 |
9.107 |
9.126 |
|
20 |
0 |
0 |
0 |
9.123 |
9.126 |
從胰蛋白腖、MgSO4·7H20與pH值交互影響DN2菌體濃度的響應麵圖(圖 1)，可直觀地看出各因子對響應值影響的變化趨勢。
2.3 響應麵優化DN2生長的外部條件
Plackett-Burman試驗結果表明，溫度、裝液量和培養時間是影響DN2生長的關鍵外在因子。Box—Behnken設計對影響 DN2生長的關鍵外在因素進行了17組試驗，結果見表3。利用Design—Expert軟件對表 3試驗數據進行二次多項回歸擬合，獲得菌體濃度對溫度、裝液量以及培養時間的二次多項回歸方程為：（略）
對回歸方程取一階偏導等於 0並整理可得培養條件最優化值為：X4=32℃，X =88ml，X =34h。 此時，最大預測菌體濃度為6．73×10 9cfu／ml。圖2是溫度、裝液量與時間交互影響 DN2菌體濃度的響應麵圖。從圖中可直觀地看出各因子對響應值影響的變化趨勢。
表3 Box-Behnken設計及其實驗結果
|
實驗編號 |
X4(溫度) |
X5(裝液量) |
X6(時間) |
菌體濃度（lg cfu/ml） | |
|
實測值 |
預測值 | ||||
|
1 |
-1 |
-1 |
0 |
9.378 |
9.385 |
|
2 |
1 |
-1 |
0 |
9.325 |
9.279 |
|
3 |
-1 |
1 |
0 |
9.166 |
9.212 |
|
4 |
1 |
1 |
0 |
9.219 |
9.212 |
|
5 |
-1 |
0 |
-1 |
9.113 |
9.120 |
|
6 |
1 |
0 |
-1 |
9.113 |
9.173 |
|
7 |
-1 |
0 |
1 |
9.590 |
9.530 |
|
8 |
1 |
0 |
1 |
9.378 |
9.371 |
|
9 |
0 |
-1 |
-1 |
9.537 |
9.524 |
|
10 |
0 |
1 |
-1 |
9.272 |
9.219 |
|
11 |
0 |
-1 |
1 |
9.590 |
9.643 |
|
12 |
0 |
1 |
1 |
9.696 |
9.709 |
|
13 |
0 |
0 |
0 |
9.696 |
9.622 |
|
14 |
0 |
0 |
0 |
9.643 |
9.622 |
|
15 |
0 |
0 |
0 |
9.643 |
9.622 |
|
16 |
0 |
0 |
0 |
9.643 |
9.622 |
|
17 |
0 |
0 |
0 |
9.484 |
9.622 |
2．4 優化前後菌株 DN2的生長曲線經過上述優化後，得到最佳培養基組成為(g／L)：胰蛋白腖 11.34牛肉膏3.00、NaCl 5.00、MgSO4·7H20 3.7l，pH值7.23；最佳外界條件：溫度32℃、轉速12Or／min、裝液量88ml／250ml三角瓶、培養時間34h。在此優化條件的基礎上進行5L發酵罐實驗，以優化前的培養基和培養條件作為對照，每4h測定培養液中的菌體濃度(圖3)。從圖3中可以看出，優化後菌株DN2達到最大生長量的時間為36h，與預測值34h基本一致，且比優化前的48h縮短約12h；最大活菌數達到6.49×109cfu／ml，比優化前的7.35×108cfu／ml提高了一個數量級，與預測值6.73×109cfu／ml較為接近。
3 結 論
本文通過Plackett—Burman實驗篩選出胰蛋白腖、MgSO4·7H20、溫度、裝液量和培養 時間為影響0．intermedium DN2菌株生長的顯著因素。在此基礎上，采用響應麵法優化菌株 DN2的培養條件，得到最佳培養基組成為(g／L)：胰蛋白腖11.34、牛肉膏3.0、NaCl 5.0、MgSO4·7H2O 3.7l，pH值7.23；最佳外界條件為溫度32℃、轉速 120r／min、裝液量 88ml／250ml、培養時間34h。在此優化培養條件的基礎上進行 5L發酵罐驗證試驗。結果表明，菌株 DN2達到最大生長量的時間為36h，比優化前縮短了約12h；最大菌體濃度為6.49×109 cfu／ml，比優化前的7.35×108cfu／ml提高了一個數量級，與預測值 6．73×109 cfu／ml較為接近。本研究結果為 0．intermedium DN2的研究與應用打下基礎。
作者：袁勇軍 黃麗金 陸兆新
作者單位：南京農業大學食品科技學院農業部農畜產品加工與質量控製重點開放實驗室 南京 210095
參考文獻 (略)
