煙堿降解細菌 Ochrobactrum intermedium DN2生長培養基及培養條件的優化研究（1）

摘要 在煙堿生物降解的研究和實際應用中，需要在較短的時間內獲得大量 0．intermedium DN2菌體。為了提高菌株DN2的菌體濃度，縮短其培養時間，本研究采用Plackett-Burman設計對影響O．intermedium DN2生長的內在和外在相關因素進行了評價。結果表明，影響菌株 DN2生長的顯著因素有胰蛋白腖、MgSO4·7H2O、初始 pH值、溫度、裝液量和培養時間。在此基礎上，采用響應曲麵法分別對該菌生長培養基的組成和培養條件進行優化，得到最佳培養基組成為(g／L)：胰蛋白腖11.34、牛肉膏3.00、NaCl 5.00、MgSO4·7H2O 3.71，pH值7.23；最佳培養條件為溫度32℃、轉速120r／rain、裝液量 88ml／250ml三角瓶、培養時間34h。5L發酵罐驗證實驗表明，菌株 DN2達到最大生長量的時間為36h，與預測值34h基本一致，比優化前縮短約12h；最大菌體濃度為6.49×10⁹cfu／ml，與預測值6.73×10⁹cfu／ml接近，比優化前高近一個數量級。

關鍵詞 O．intermedium DN2 培養基組成培養條件 Plackett-Burman設計  響應曲麵法

煙堿是普通煙草中的生物堿，俗稱尼古丁(nicotine)。煙堿既是成癮物質也是有毒物質。成人一次攝入40～60mg尼古丁，就可能致命。在煙葉和煙草製品的生產過程中會產生大量的固體、液體和氣體廢棄物，其中煙堿的平均含量高達 18g煙堿／kg幹重。在歐洲，當每kg煙草廢棄物(幹重)中煙堿含量超過500mg時，就被歸類為“有毒和有害物質”。1994年以來，美國一直把煙堿列在美國排放毒性化學品目錄(Toxics Release Inventory，TRI)中。據報道，我國每年產生的煙草廢棄物約100萬噸。這些廢棄物如果不加處理就投放到環境中，會破壞生態環境，危害人類健康。目前，國外研究者已從環境中分離了多種煙堿降解菌，而國內在這方麵的研究較少。實踐證明，生物降解法是去除或減少煙草廢棄物中煙堿的有效途徑。

本實驗室從土壤中分離到一株新的煙堿降解細菌，鑒定為Ochrobactrum intermedium DN2 13,14]。學者們對0．intermedium的認識較晚，Velasco等在 1998年才首次描述了其特征。目前培養該菌主要是用 LB培養基，但菌株 DN2從斜麵培養基接種到普通的牛肉膏蛋白腖培養基中，遲滯期長，菌體含量較低。這不僅降低研究效率，也會使生產成本增加，不利於將來的大規模應用。為縮短製備種子液的時間，提高種子液中菌體的濃度，本研究分兩階段分別采用 Plackett—Burman篩選實驗和響應曲麵法(response surface methodology，RSM)對該菌生長的培養基及培養條件進行優化。

Plackett—Burman設計法是基於不完全平衡塊原理，能從眾多變量間快速有效地篩選出最為重要的因素。響應曲麵法是綜合實驗設計和數學建模，通過局部實驗回歸擬合因素與結果間的全局函數關係，同時對影響生物產量的各因子水平及其交互作用進行優化與評價。與傳統優化方法相比，RSM所需的實驗組數相對較少，可節省人力、物力。該法已經廣泛地應用於各類培養基以及發酵條件的優化。

1 材料與方法

1.1 材料                 

1.1.1  供試菌株 0．intermedium DN2，本實驗室從土

壤中分離得到。

1.1.2 培養基  種子培養基(g／L)：牛肉膏3.0、蛋白腖 10.0、NaCl 5.0，pH值 7.0；斜麵培養基：種子培養基添加2.0％瓊脂，斜麵-4℃冰箱保存；活菌計數培養基：同斜麵培養基；Plackett-Burman實驗培養基：按照實驗設計配製；旋轉中心組合設計 (central composite rotable design，CCRD)實驗培養基：以不加蛋白腖的種子培養基為基礎，按照實驗設計添加胰蛋白腖和MgSO4·7H20配製不同初始 pH值的培養基；Box-Behnken實驗培養基：CCRD優化後的培養基。

1.2 方法

1.2.1  培養條件和方法  從新鮮斜麵上取一環菌體接入種子培養基，30℃，120r／min搖床培養 48h，製得種子液(菌體濃度為 7.06×10 cfu／ml)。以 1％接種量(v／v)接入各培養基中，其它條件依據不同的試驗要求具體確定。CCRD的培養條件：裝液量為 100ml／250m1三角瓶，30℃，120r／min搖床培養24h。

1.2.2 菌體濃度的測定 平板塗布法 ：將培養液適當稀釋，吸取 lml稀釋液塗布於活菌計數平板上。37％恒溫培養 48h後，進行菌落計數。結果以 lg cfu／ml報告菌體濃度。

1.2.3 實驗設計 (1)Plackett-Burman實驗設計：依據前期的實驗結果以及細菌生長所需營養要素的基本原則和影響細菌生長的主要外界條件，選取 15種相關的內在和外在因素為考察對象。它們的取值範圍分別為：葡萄糖2.O0～5.O0g／L、蔗糖 2.00～5.00g／L、胰蛋白腖2.50～5.O0g／L、蛋白腖 2.50～5.00g／L、酵母膏1.00～2.00g／L、NH4NO3 1.O0～2.00g/L、NaCl 1.O0～3.O0g／L、MgSO4·7H2O 0.50 —1.00g／L、FeSO4·5H2O 0.01～0.03g／L、KH2PO4 1.00～3.00g／L、溫度 30～35℃、轉速120～180r／rain、裝液量50.0～100.0ml、初始 pH值6.0～7.0以及培養時間10～14h。設 2個重複，以菌體濃度平均值為響應值。本試驗設計、數據分析及模型建立由JMP軟件(version4.0.5，SAS Institute)輔助完成。實驗設計方案略。(2)RSM實驗設計：基於 Plackett-Burman試驗結果，采用 CCRD設計對影響菌株 DN2生長的關鍵內在因素進行研究和探索，以獲得影響該菌生長的最佳培養基組成及其濃度水平範圍。采用 Box-Behnken設計對影響該菌生長的關鍵外在因素進行研究。設 2個重複，以菌體濃度平均值為響應值。實驗因素水平及其編碼見表 1。實驗輔助軟件為 Design Expert(version 6.0.5，Stat-Ease Inc．，Mninneapolis，MN，USA)。

表 1  實驗因素水平及其編碼表

A:x1=(X1-10)/5; x2=(X2-4)/2; x3=(X3-7.25)/1.25; x4=(X4-31)/6;x5=(X5-60)/40;x6=(X6-20)/4

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