微生物來源的Xa因子抑製劑F022172的研究

【摘要】  利用一種由本中心建立的Xa因子抑製劑高通量體外篩選模型，從大量真菌菌庫及其來源的代謝產物中篩選到了一株可產生陽性活性化合物的菌株F02ZA2172，該菌株的發酵液經有機溶劑提取、矽膠柱色譜、ODS柱色譜、Sephadex LH20柱色譜及HPLC製備分離，得到F022172A、B和C三個活性化合物。經紫外、質譜、核磁等理化數據分析，確定這三個化合物分別與已知化合物6epiophiobolin K、ophiobolin K和ophiobolin G的結構相同，但該類化合物對Xa因子的抑製活性至今未見報道。

【關鍵詞】  微生物 Xa因子抑製劑 二倍半萜

    F022172, factor Xa inhibitors from metabolites of microorganisms

     ABSTRACT  A high throughput screening model was established for screening factor Xa inhibitors from thousands of strains of fungi, as a result, a strain, F02ZA2172 with potent suppression activity was isolated. The culture broth of it was processed by solvent extraction, silica column chromatography, Sephadex LH20 column chromatography and ODS HPLC preparation to obtain three pure active compounds named F022172A, B and C. Their chemical structures were elucidated as the compounds named 6epiophiobolin K, ophiobolin K and ophiobolin G by physicochemical properties and spectral data of UV, MS, 1HNMR and 13CNMR respectively. The compounds are reported as factor Xa inhibitors for the first time.

    KEY WORDS  Microorganisms;  Factor Xa inhibitor;  Sesterterpenes

   血栓的形成是心血管疾病(如心肌梗死、中風、深度靜脈血栓、肺栓塞等)重要致病因素，抗血栓治療一直是這類疾病搶救措施及預防策略的核心，其中抗凝血是抗血栓治療的重要方法之一，因此，尋找更加安全、高效的抗凝血藥物在臨床治療上具有重要的意義。 Xa因子(factor X activated，factor Xa)是一種絲氨酸蛋白酶，位於血液凝集級聯的上遊，處在連接內源性和外源性激活途徑共同通路的中心位置，Xa因子抑製劑既能阻斷內源性凝血亦能抑製外源性凝血的發生［1］。Xa因子是凝血酶生成的限速成分，由於在血液凝集級聯反應過程中還存在生物信號的放大，估計一個Xa因子抑製劑分子能抑製138個凝血酶分子的生理效果， Xa因子抑製劑可能比凝血酶抑製劑更為有效［2］。Xa因子隻單純促進凝血，沒有凝血酶抑製劑的副作用，因此，Xa因子抑製劑成為近年來抗凝血藥物研究的熱點之一，有些藥物已經上市［如Organon公司和SanofiSynthelabo公司共同開發的磺達肝素鈉(fondaparinux sodium，商品名：方達帕魯)於2001年12月在美國獲得FDA批準［3］］或正在開發中［4］。

    本實驗室建立了一個快速的高通量篩選方法，從大量土壤真菌代謝產物中篩選Xa因子抑製劑，篩選得到陽性菌株F022172。本文報道其發酵、分離、結構鑒定和生物學活性。

    1  材料與方法

    1.1  篩選用微生物的菌株

    真菌菌株由本中心從雲南和新疆采集的土壤中分離得到。

    1.2  試劑及儀器

    Xa因子和底物MCA(BocIleGluGlyArg7amido4methylcoumarin hydrochloride)購自美國Sigma公司；色譜乙腈購自Merck公司；Victor2多標計數儀(美國PE公司)；中壓層析係統(德國BUCHI公司)；高效液相係統(美國Waters公司515泵和PDA檢測器)；高效液相柱Phenomene C18(20mm×250mm，10μm)；核磁共振儀 500MHz(Inova)；質譜儀(AutospecUltima)。

    1.3  Xa因子活性測定方法

    活性測定方法由本中心建立，原理是Xa因子可以水解特定的熒光標記多肽底物，通過熒光值的變化計算抑製劑對酶的抑製活性。

    活性測定反應在96孔板進行，樣品孔中加入0.1mol/L Tris(pH8.0，10mmol/LNaCl，10mmol/L CaCl2)、適量的酶液(Xa因子)和樣品的DMSO溶液；對照孔以DMSO代替樣品溶液；空白管以DMSO代替樣品溶液並以Tris緩衝液代替酶液，在37℃保溫15min，測定熒光F1(Ex355nm/Em460nm)；各孔加入底物，37℃保溫1h，測熒光F2。其中，抑製率大於80%的樣品為陽性。

    樣品抑製率(%)=［F2-F1］(對照)-［F2-F1］(樣品)［F2-F1］(對照)-［F2-F1］(空白)×100%

    1.4  真菌F022172的培養

    將菌株F02ZA2172斜麵接種於種子培養基(澱粉2%，葡萄糖1%，黃豆餅粉0.2%，麥芽粉0.6%，酵母0.5%，CaCO3 0.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，NaCl 0.2%，pH7.0)，27℃，220r/min搖瓶培養3d。按1%接種的量接種到固體培養基(大米97.5%，黃豆餅粉2.5%)27℃培養14d。

    1.5  F02ZA2172的提取分離

    F02ZA2172固體培養物2kg，用2000ml乙酸乙酯萃取，減壓蒸去溶劑得到深褐色油狀物3.5g。上述粗提物經矽膠柱(2.6cm×50cm)色譜，正己烷乙酸乙酯梯度洗脫，每50ml收集一管，合並活性組分，減壓蒸幹。活性物質部分用ODS反相中壓柱色譜(Merck ODS C18，40μm，1.6mm×50mm)進一步分離純化，然後用製備型HPLC進行單組分的製備［流動相為CH3CNH2O(85∶15，V/V)，流速6ml/min，檢測波長240nm］，得到F022172A(25.0mg)、B(39.3mg)和C(12.4mg)三個活性化合物。

    2  結果

    2.1  F022172A、B和C的理化性質及結構

    F022172A  無色粉末，易溶於甲醇、丙酮，氯仿，UVλmax(MeOH)為241nm。ESIMS的測定結果顯示該化合物的分子量為384.3，分子式為C25H38O3，1H和13CNMR數據見Tab.1；經紫外、質譜、核磁等理化數據分析並與文獻［5］對照，確定該化合物為6epiophiobolin K，化學結構見Fig.1。

    F022172B  無色粉末，易溶於甲醇、丙酮，氯仿，UVλmax(MeOH)為239nm。ESIMS的測定結果顯示該化合物的分子量為384.3，分子式為C25H38O3，1H和13CNMR數據見Tab.1；紫外、質譜、核磁等理化數據分析並與文獻［5］對照，確定該化合物為ophiobolin K，化學結構見Fig.1。

    F022172C  無色粉末，易溶於甲醇、丙酮，氯仿，UVλmax(MeOH)為238nm。ESIMS的測定結果顯示該化合物的分子量為384.3，分子式為C25H36O2，1H和13CNMR數據見Tab.1；紫外、質譜、核磁等理化數據分析並與文獻［6］對照，確定該化合物為ophiobolin G，其化學結構見Fig.1。

    2.2  F022172A、B和C的生物活性

    利用本中心建立的體外篩選模型，測定了6epiophiobolin K(F022172A)、ophiobolin K(F022172B)和ophiobolin G(F022172C)三個化合物對與凝血相關的幾個酶的抑製活性，它們對Xa因子的活性在1mmol/L濃度以下，對凝血酶(thrombin)和纖溶酶(fibrinolysin)沒有抑製活性，IC50分別為27.1、3.39和56.7μg/ml。

    3  討論

    Ophiobolins(蛇孢假單殼素)是一族具有三環或四環結構的二倍半萜類化合物，具有殺線蟲、抗真菌、抗細菌和細胞毒等多種生物活性［7］。Ophiobolin A是該類化合物中第一個被發現的，它的結構是通過其溴甲氧化衍生物的x射線單晶衍射得到的［8］，文獻報道該化合物具有抑製鈣活化的環核苷磷酸二酯酶和誘導L1210細胞凋亡的作用［9］。Ophiobolin K具有殺線蟲的作用，而6epiophiobolin K沒有活性［5］。本研究測定了6epiophiobolin K(F022172A)、ophiobolin K(F022172B)和ophiobolin G(F022172C)三個化合物對與凝血相關的幾個酶的抑製活性，發現在1mmol/L濃度下它們對凝血酶和纖溶酶沒有抑製活性，隻特異性的對Xa因子有抑製活性，而且ophiobolin K對Xa因子的抑製活性比6epiophiobolin K和ophiobolin G強8～18倍，進一步的構效關係研究需找到或分離更多的同係物，此項工作正在進行中。

 

【參考文獻】
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［8］ Morisaki M, Nozoe S, Iitaka Y. Xray studies of C25 terpenoids I. The crystal structure of ophiobolin methoxybromide ［J］. Acta Crystallogr B,1968,24(10):1293

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