摘 要 以一株從我國山東海域爆發弧菌病鱸魚體內分離得到的病原菌鰻弧菌(Vibrioanguillarum MV425 O1型)為研究對象，對其實現高密度生產海洋魚類弧菌病疫苗的培養基進行了優化研究研究表明，碳源和 NaCl造成的滲透壓以及 由發酵碳源和氪源導致的pH值變化是影響細胞正常生長的重要因素。海水由微量元素(除鐵元素)對菌體生長的作用可被酵母浸出物補償，高鐵濃度有助於菌體 生長。在確定顯著影響因子的基礎上，采用可旋轉中心複合設計方靠和響應麵法進行了統計模型優化，優化設計有效地提高了細胞培養密度，實現在搖瓶條件下細胞幹重5．8g／L和 30L 規模反應器中26.2g／L的較好的初步放大結果，並可替代海水培養基。
關鍵詞 鰻弧菌(Vibrio anguillarum)，培養基優化，高密度培養，海洋魚疫苗
0 引言
隨著集約化、高密度養殖的迅速發展，海水經濟魚類養殖業將受到各種魚類疾病爆發的困擾。如何有效控製這些疾病已成為現今水產養殖業所麵臨的一個十分迫切的問題。海洋魚類疫苗作為一種環境友好和及時的疾病控製措施，正受到水產業的廣泛重視和積極開發。從產業化角度出發，成功的商業化魚疫苗必須具備遺傳穩定、高生產率和低生產成本特性，而實現後兩者的一個主要要求是應用低廉的培養基成分和簡單的培養基配製方法。實現單位培養體積的高細胞量。
鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是一種可導致多種海洋魚類弧菌病 (Vibriosis)的高致病性病原體，在我國，它也是危害多種海洋經濟魚種的主要病害病原體。國外針對鮭魚類及基於海水培養基的鰻弧菌滅活疫苗已經開發成功多年，但我國目前尚未建立起任何形式的海洋魚類疫苗的生產體係。鑒於海水培養基的無菌化操作的繁瑣和經濟性考慮及其它限製，開發新型簡易的低成本海洋鰻弧菌疫苗培養基十分必要。本研究采用一株從山東海域海水養殖場爆發弧菌病病魚體中分離篩選到的鰻弧菌(Vibrio anguillarum MVM425 O1)為出發株，對其實現高密度培養的非海水培養基進行了優化設計。
1 材料與方法
l.l 菌株
鰻弧菌(Vibrio anguillarum，01血清型 ) MVM425從山東黃海海域高密度養殖鱸魚 (Lateolabraxiaponicus)爆發弧菌病的病魚體內分離得到，該菌株由本室保藏，具有強弧苗病致病力。
l.2 培養條件
種子培養采用 Luriai-Bertani培養基，補加2％NaCl(LB-20)，於28℃下振蕩培養 24h(15O r／min)。培養成熟後按l0％接種量轉入裝液量50ml的250ml搖瓶．於上述同樣條件下振蕩培養，培養基為根據具體實驗考察對象添加相應營養因素的海洋極限培養基改造而成。微量元素和維生素濃縮液配製參見文獻。所有培養基滅菌前，pH值調整至7.5。為防止沉澱和營養因子之間的破壞性反應，分成有機營養、無機鹽、微量元素和碳源(含MgCl和CaCl2)四個部分，分別滅菌(0.08MPa，20min)。
1.3 分析方法
菌體濃度采用在550nm下測定OD值，計算單位體積細胞數．細胞幹重為高速離心(10000g，10min，4℃)收集菌體後真空幹燥，測定相應體積樣品菌重 ．計算濃度。
1.4 響應麵方案設計和模型分析
在各單因素篩選的基礎上，選擇蔗糖、NH4Cl和 NaCl為優化對象，采用一種可旋轉的中心複台設計進行了優化分析。各獨立和非獨變量之間的交互作用由下列二次多項式方程給出：（略）
表 1 鰻弧菌(V.anguillarum)高密度培養優化（略）
2 結果與討論
2.1 營養因素考察篩選
采用上述相應的基本培養基，考察了12種營養因素對鰻弧菌細胞生長的影響 (主要以24h時的細胞終密度為考察指標)。在碳源的篩選實驗中，蔗糖和麥芽糖對細胞生長的促進作用明顯高於其它碳源，葡萄糖和果糖在濃度不大於1％時對細胞的生長表現為積極作用(見圖1)，為雙糖促細胞生長效應時濃度的一半 根據等摩爾濃度溶液具有等滲透壓的理論，2％的蔗糖和麥芽糖同1％的葡萄糖和果糖溶液的滲透壓大體相當。所以，有可能認為高糖濃度對 V.anguilarum生長的抑製作用是由於所造成的超適滲透壓環境所致。
關於滲透壓對細胞生長的影響見圖 2。隨著培養基中滲透壓的增加(通過添加蔗糖形成).比生長速率(μ )和細胞產量(OD)分別下降了47％和29％左右 當培養基中加入 1mmol／L的甜菜堿(滲透壓保護劑)後，這種抑製現象被消除；另外當培養基中含有酵母浸出物時．這種由滲透壓帶來的抑製現象也被削弱，這可能是由於酵母浸出物中台有天然存在的甜菜堿類物質的緣故。
從各碳源發酵培養的最終pH值來看，另一個潛在的抑製細胞生長的重要因素可能是高糖濃度代謝產生更多的酸導致的過低pH值(見圖 3) 繼續增加糖濃度，滲透壓成為主要影響因素，抑製了菌體生長，繼而對底物糖的代謝減少，產酸下降．pH值的下降幅度減弱．最終pH值反而上升。從降低培養基成本的角度考慮 ，蔗糖顯然為最佳碳源。
對於氮源來說，NH4Cl和蛋白腖在低濃度時對細胞的生長起正麵促進效應。作為一種酸性氮源． NH4 Cl的代謝將導致低的pH值培養環境，從而進一步阻礙鰻弧菌細胞的生長。由於蛋白腖具有一定的緩衝作用，所以它比 NH4Cl在更寬的濃度範圍內不呈現明顯的不適宜影響。正如圖 5所示，使用磷酸鹽緩衝液將明顯改善細胞的生長。
微量元素(除鐵元素)和維生素在所考察的添加量範圍內對細胞的生長沒有表現出明顯的影響：這一結果表明,作為培養基的一個基本和富養組分．酵母浸出物可基本滿足鰻弧菌對微量元素和維生素的營養需求。隨著鐵離子(Fe3+)濃 度添加量從 0至 0.5mmol／L增加，細胞的密度表現出明顯的提高(約2倍)。繼續增加鐵濃度 (0.5～1.0mmol／L)則對細胞的生長促進作用呈現出一種飽和效果 圖 6顯示．富鐵營養將會增加細胞的生長速率並延長對數生長期約4h，從而最終實現細胞密度的提高。
鐵作為細菌生長的一種必需營養參與了許多生物過程．如電子傳送鏈和某些 中問代謝酶的輔因子。然而．在有氧條件和近乎中性pH值環境中，鐵呈不溶解礦物質狀態，類似甚至更為苛刻的鐵營養限製也廣泛存在於生物係統內．因此，擁有一種特殊的鐵攝取係統以克服這種由宿主體或環境造成的鐵營養限製對於許多細菌的正常生存至關重要”鰻弧菌V.anguillarum (O1型)多種海洋魚類弧菌病的病原體正是這樣一種生物進化結果的代表性微生物。雖然目前對於鐵元素在這一微生物生物過程中的角色問題還不是十分清楚，但已有的事實可以肯定，鐵營養的攝取正常與否將嚴重影響細胞的生長，同時業已證實，這一體係的台成嚴格受到外界環境中鐵離子濃度的調控．在富鐵營養環境中生長中，鰻弧菌不台成鐵攝取係統；當環境中鐵離子的濃度較低時，細胞就會在胞內一質粒的編碼下合成此係統：並且由這種鐵攝取係統完成的鐵輸送過程是一種耗能過程；因此，鐵濃度增加對細胞生長的顯著促進作用可能是由於足夠的鐵濃度改變了鰻弧菌的代謝響應．節約了為合成一種鐵攝取係統所需的營養組分和能量，同時．也節省了運行這套鐵攝取係統應該消耗的能量。
需要特別指出的一個現象是，在我們進行鐵元素攝取動力學的研究中(將另文發表)證實，高濃度的鐵離子可形成礦物化細胞表麵，因此，高濃度鐵離子對細胞生長的促進作用的另一個機製．可能是由其形成的細胞礦物表麵通過增加對可利用底物的轉化效率．達到促進有機底物的利用，從而增進了細菌的生長。
2.2 響應麵優化
在上述營養因素篩選考察結果的基礎上．選擇蔗糖、NH4Cl和 NaCl作為進一步優化因素，采用響應麵方法建立統計模型。各項變量的模型參數和方差分析結果在此略去．方程相關係數為 0.976，表明所得統計模型可較好地指導實驗優化參數。響應曲麵圖如圖 6所示
隨著蔗糖濃度的增加，細胞密度在2％(w／v) 糖濃度時達到最大值，繼續增加糖濃度將導致細胞密度下降，因此 20g／L蔗糖濃度為最優。同樣．從圖中可以看到 NaCl濃度也有一個峰值．過低或過高的鹽濃度都不利於細胞生長。在 2O～25g／L濃度範圍內，細胞生長較好：這一數值同養殖地的海水鹽度非常吻合，從另一個角度為“鰻弧菌對海水的依賴更多地是源於海水鹽度形成的適宜滲透壓環境”的設想提供了佐證。需要特別指出的是，NaCl最適濃度的波動受到蔗糖濃度變化的交互影響，因此，非海水培養基的優化應將模擬這樣一種適滲壓 環境作為一個重點方麵。HCl的最優濃度範圍在lg／L左右，同前麵單因素考察的數值一致。為了評估統計模型優化數據的可靠性，根據計算優化濃度進行驗證實驗(共五次)．並同海水培養基進行了對照。取得了平均細胞光密度值0.92， 細胞幹重 5.8±0.21g的結果，同模型的預測計算值 0.848較為吻合，同海水培養基條件的l.O5較為接近，證明模型是可靠的，可以作為優化培養基的參考.在30L規模反應器中的初步放大培養中，利用優化培養基取得了細胞幹重26.2g／L的較好結果。
3 結論
高濃度碳源和氮源對細胞生長的抑製作用主要是由於它們代謝時造成的低 pH值環境。雖然鰻弧菌V.anguillarum在一定程度上是一種嗜滲壓細菌，但過度的滲透壓仍將對其生長產生不良影響。基於疫苗生產成本上的考慮，蔗糖和NH4Cl被選擇為最佳的碳氯源。采用響應麵法對V.anguillarum非海水培養基優化得到最佳碳氮源和鹽度為：蔗糖 20g／L，NH4Cl l.0g／L，NaCl 25g／L 。海水中微量元素對細胞生長的作用基本上可被複合培養基組分代替。海水對鰻弧菌生長的最大適應性可能在於其提供的適滲透壓環境和礦化表麵，優化非海水培養基必須模擬這種環境一高鐵濃度對鰻弧菌生長的顯著促進作用除了鐵營養參與許多胞內重要生物過程外，另一個作用機製可能是其形成的礦化細胞表麵促進了細胞對外界營養底物的轉化利用效率，本研究的培養基鐵元素優化濃度為 0．4mmol／L。 從搖瓶的結果來看，可以預測，反應器的應用將克服許多培養調控操作上的障礙，進一步大幅度提高細胞的培養密度。利用優化培養基實現了 30L規模反應器細胞幹重密度 26.2g／L的初步放大結果，為進一步的鰻弧菌疫苗生產開發打下了基礎。
作者：馬 悅 張元興 孫修勤
參 考文獻 ： （略）
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