【摘要】 目的 建立硫酸慶大黴素顆粒效價的測定方法。 方法 采用比濁法和管碟法對硫酸慶大黴素顆粒的效價測定進行比較,並對比濁法進行方法學驗證。結果 用比濁法測定硫酸慶大黴素顆粒效價,濃度的對數與吸收度成良好的線性關係,回收率良好;用比濁法測定與管碟法測定的結果無明顯差異,方法學驗證說明濁度法測定可行。結論 微生物濁度法測定硫酸慶大黴素顆粒效價的方法可行,且快速、簡便。
【關鍵詞】 微生物效價測定; 濁度法; 管碟法; 硫酸慶大黴素顆粒
硫酸慶大黴素是氨基糖苷類抗生素,由多個組分組成,其抗菌機理主要是阻礙細菌蛋白質的合成而殺菌,也是現在使用較為廣泛的抗生素。由於硫酸慶大黴素組分較多,用化學檢測方法還不能完全體現其抗菌能力,所以效價測定在控製其質量方麵還不可替代。現在常用的效價測量方法還普遍是二劑量管碟法,但是管碟法也有其缺點[1],如檢測時間過長,參數不穩定,受外界幹擾較大等。2005年中國藥典收載了比濁法測定抗生素效價的方法[2,3],但在實際檢驗中應用尚少,由於顆粒劑含有大量輔料,測定時更應考慮到相關輔料的影響。本研究參考了硫酸慶大黴素原料及片劑的濁度法測定方法[46],對用濁度法硫酸慶大黴素顆粒劑效價進行了研究,現將具體的試驗內容報告如下。
1 儀器與試藥
CZB1抗生素光度測量儀(北京潮聲弘業科技有限公司);ZY300IV多功能微生物自動測量分析儀(北京先驅威鋒技術開發公司);島津UV2450分光光度計;BP211D電子天平(Sartorius,瑞士)。試驗中所用的比色皿,培養基等均在115℃滅菌30 min.慶大黴素標準品(中國藥品生物製品檢定所,批號:130326200314,效價:638 u/mg);金黃色葡萄球菌 [CMCC(B)26003](中國藥品生物製品檢定所);抗生素檢定培養基Ⅲ(北京三藥科技開發公司);營養肉湯培養基(北京三藥科技開發公司);硫酸慶大黴素顆粒A(A廠家,規格40 mg/包,批號:070502,070503);硫酸慶大黴素顆粒B(B廠家,規格10 mg/包,批號:080403,080404)。
2 實驗方法
2.1 菌懸液的製備和含菌培養基的製備取金黃色葡萄球菌斜麵培養物,接種於50 ml營養肉湯培養基中,置35～37℃培養約18 h,臨用前以營養肉湯培養基為空白在550 nm的波長處測定其吸收度,調整菌液濃度使吸收度為1.0.在抗生素檢定培養基Ⅲ中,加入上述實驗菌液,加入量為1%(每100 ml中加實驗菌液1 ml),搖勻,立即使用。並以未加菌的抗生素檢定培養基Ⅲ為陰性空白。
2.2 線性範圍及線性關係取慶大黴素標準品適量,精密稱定,用滅菌磷酸鹽緩衝液(pH7.8)製成100 u/ml的溶液,再稀釋製成 1.0、0.8、0.64、0.52、0.41 u/ml溶液,作為線性實驗標準溶液[5]。取上述標準品溶液各1.0 ml,置儀器配備的比色管中,再分別加入含菌培養基9.0 ml,搖勻,密塞,放入CZB1抗生素光度測量儀培養。以不含菌液培養基9.0 ml和1.0 ml無菌水作陰性空白,以含菌液培養基9.0 ml和1.0 ml無菌水作陽性空白。培養溫度37℃,測定波長為530 nm.試驗設定的5個濃度的標準品溶液劑間比為1∶1.25,從0.4 u/ ml～1.0 u/ ml,吸收度大概在0.2～0.6之間,相鄰劑量間的吸收度差約為0.07,有較明顯的劑間差。以濃度(C,u/ ml)的對數為橫坐標X,吸收度(A)為縱坐標Y進行線性回歸,顯示線性關係良好,線性方程為:Y=289.380-869.151 X,r=0.999 0.慶大黴素的濃度劑量為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml時,吸收度約為0.3～0.6,選取這兩個濃度作為二劑量測定時的抗生素濃度,高低劑量比為2∶1.
2.3 回收率考察精密稱取慶大黴素標準品適量,用滅菌水製成1 000 u/ ml的標準品溶液。精密量取適量,用滅菌磷酸鹽緩衝液(pH7.8)分別稀釋製成濃度為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的標準品溶液;分別取相當於標示量的85%、100%、115%慶大黴素標準品,按硫酸慶大黴素顆粒處方中慶大黴素與輔料的比例分別加入相應劑量的輔料,同法稀釋製成濃度為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的溶液。分別精密量取上述溶液1.0 ml,置滅菌比色管中,每種溶液各6管,照2.2所述方法測定。回收率在99.3%～101.1%之間,平均回收率100.3%,回收良好，結果見表1.表1 硫酸慶大黴素回收率試驗結果
2.4 重複性試驗分別取相當於標示量85%、100%、115%慶大黴素標準品適量,按照硫酸慶大黴素處方中慶大黴素與輔料的比例分別加入相應劑量的輔料,同法稀釋製成濃度為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的溶液,用二劑量法分別測定含量3次,其RSD分別為1.6%,1.0%和1.2%.
2.5 輔料的影響取空白輔料,按照硫酸慶大黴素顆粒中輔料的量配製不含主藥的空白溶液,照上述方法測定,其生長曲線和陽性對照完全一致,沒有抑菌作用,說明空白輔料對實驗無幹擾。
2.6 濁度法和管碟法測定結果的比較取慶大黴素標準品及樣品適量,精密稱定,用滅菌水製成1 000 u/ ml的標準品溶液,精密量取適量,用滅菌磷酸鹽緩衝液(pH7.8)分別稀釋製成濃度為1.0 u/ ml和0.5 u/ ml的溶液,高低劑量的劑間比為2:1.分別精密量取上述溶液1.0 ml,置滅菌比色管中,每種溶液各6管,分別加入含菌培養基9.0 ml,搖勻,密塞,放入CZB1抗生素光度測量儀培養3～4 h.陰性對照:磷酸鹽緩衝液(pH7.8)1 ml,加9.0 ml未接種實驗菌的培養基。分別用管碟法和濁度法的二劑量法對4批硫酸慶大黴素顆粒樣品進行含量測定,對4批樣品用管碟法和濁度法測得的含量基本一致,可信限FL(%)濁度法更佳,兩種方法無顯著差異,結果見表2.表2 濁度法與管碟法測定硫酸慶大黴素結果比較
3 討論
3.1 試驗菌液的製備和對試驗的影響濁度法測定效價試驗中,試驗菌液的製備和質量是影響實驗的重要因素。製備試驗用菌液有不同的方法[710],采用斜麵接種試驗菌後再用滅菌水洗下菌體製備菌液也可用於試驗,但是由於接種量難以控製,後期調整菌液濃度操作會更加繁瑣,而采用這種液體培養基培養菌液的方法更加簡便,更容易控製菌液的濃度,同時解決了從斜麵培養基上直接洗下菌體製成的菌懸液菌體不均勻的問題。
3.2 濁度法測定的注意事項用濁度法測定時,培養時間一般為3～4 h,但最主要的還是要觀察培養皿內的菌液生長情況,以菌液的吸收度在0.3～0.7的範圍內的時間為最佳,而且高低濃度之間的吸收度差值應大於0.1,這樣才能獲得較好的結果。
3.3 輔料量對試驗的影響采用管碟法測定硫酸慶大黴素顆粒效價時,發現由於顆粒劑輔料量很大,對試驗結果有一定的影響,而采用濁度法測定時,由於測定濃度很低,樣品溶液中輔料的濃度相應也減少很多,對試驗基本無幹擾。
3.4 濁度法測定效價的優勢濁度法較管碟法測定效價更加簡便、快捷,管碟法培養時間長,一般要16～18 h,要第2 d才能有結果,而濁度法試驗當天便可有試驗結果;同時,濁度法更少了手工製備雙碟的步驟,減少了人為的誤差,試驗結果中可信限(FL%)大大提高。
【參考文獻】
[1] 黃鏡娟.管碟法測定抗生素效價結果的影響因素分析[J].現代醫藥衛生,2006,22(18):2853.
[2] 國家藥典委員會.中國藥典(二部)[M].北京：化學工業出版社，2005:附錄79.
[3] 楊亞莉,胡昌勤.中國藥典2005年版微生物檢定法的增修訂情況及要點[J].中國抗生素雜誌,2005,30(12):721.
[4] 霍啟錄,邵紅霞.微生物比濁法與管碟法測定硫酸慶大黴素效價的評價[J].中國藥房,2000,11(1):37.
[5] 田光彩.標準曲線法測定硫酸慶大黴素片的抗生素效價[J].中國藥業,2007,16(15):33.
[6] 毛影.硫酸慶大黴素生物檢定結果準確度探討[J].畜牧市場,2008,21(3):50.
[7] 範彬,楊雁莉,康勇.微生物濁度法測定吉他黴素的效價[J].藥物分析雜誌,2008,28(7):1114.
[8] 郭鈁,蔡美明.微生物濁度法測定紅黴素及其製劑的效價[J].藥學與臨床研究,2007,15(4):326.
[9] 霍天鳳,趙素珍,宋閆軍.微生物濁度法測定乙酰螺旋黴素的效價[J].醫藥論壇雜誌,2006,27(20):37.
[10] 李正群,薑紅.比濁法測定氯黴素注射液含量[J].中國藥師,2002,5(10):611.
下一篇：常用的細胞量測定法
