【摘要】 目的建立消痛貼膏微生物限度檢查方法。方法參照《中國藥典》2005年版微生物限度檢查方法，采用常規法和培養基稀釋法進行該藥品的微生物方法學驗證。結果采用常規法時，白色念珠菌、黑曲黴的菌回收率均高於70 %，采用培養基稀釋法（0.2 ml/皿）時，金黃色葡萄球菌、枯草杆菌、大腸埃希菌的菌回收率均高於70 %；細菌計數可用培養基稀釋法（0.2 ml/皿），黴菌和酵母菌計數可用常規法，控製菌銅綠假單胞菌可用常規法檢查，金黃色葡萄球菌可用200 ml培養基稀釋法檢查。結論該法能有效地消除藥品中抑菌物質的幹擾，檢出率高。
【關鍵詞】 微生物限度檢查法； 方法學驗證； 消痛貼膏； 回收率
消痛貼膏是藏藥外用貼膏劑，其功能主治為活血化淤、消腫止痛，用於治療急慢性扭挫傷、跌打淤痛、骨質增生、風濕及類風濕疼痛、落枕、肩周炎等。其主要成分為薑黃、花椒、水柏枝、獨一味、棘豆等，其輔助藥物潤濕劑的主要成分為冰片、樟腦、乙醇等。按照《中國藥典》2005年版要求［1］，筆者進行了消痛貼膏微生物限度檢查方法的驗證實驗。由於該藥品的劑型獨特，用藥時將潤濕劑加至藥芯上，二者結合體直接接觸患者皮膚，並起到藥效作用，所以在實驗中以潤濕劑加至藥芯後的結合體作為驗證對象。實驗中發現，由於此藥物處方中有薑黃、花椒、冰片、樟腦、乙醇等，均含有抑菌性，對於某些細菌的生長繁殖有一定的抑製作用，所以采用常規法、培養基稀釋法，以消除抑菌成分的幹擾，並探討該法檢出藥品中汙染存活的細菌數量的有效性。
1 器材
1.1 菌種枯草杆菌［CMCC（B）63501］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、金黃色葡萄球菌 ［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、黑曲黴［CMCC(F)98003］、白色念珠菌［CMCC (F) 98001］。
1.2 培養基試劑膽鹽乳糖培養基；營養肉湯培養基；營養瓊脂培養基；玫瑰紅鈉瓊脂培養基；蛋白腖；真菌瓊脂培養基；（中國藥品生物製品檢定所）。
1.3 試藥消痛貼膏（奇正藏藥集團，批號分別為：051073、051074、051178。）
1.4 儀器隔水式電熱恒溫培養箱(型號:PYX-DHS,上海躍進醫療器械廠生產)；黴菌培養箱(型號:MJX-190-Ⅱ,廣東省醫療器械廠生產)；電熱恒溫幹燥箱(型號:DHG-9077,上海精宏實驗設備有限公司生產)；全自動高壓蒸氣滅菌鍋(型號:LDZX-40SBI,上海申安醫療器械廠生產)；淨化工作台(型號:SW-CJ-2F,蘇州淨化設備有限公司生產)。
2 方法
2.1 菌液製備接種金黃色葡萄球菌、枯草杆菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物於營養肉湯培養基中, 30～35℃培養18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養物於改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48 h,上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至50～100 cfu/ml。接種黑曲黴的新鮮培養物於改良馬丁培養基斜麵，培養5～7 d，加入5 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，洗下黴菌孢子，吸取孢子菌懸液1 ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10-4（含孢子數為50～100 cfu/ml）。
2.2 供試品的處理取2貼，揭除瓦楞膜，將潤濕劑加至藥芯表麵後剪碎（相當於10 g），加至pH 7.0的100 ml氯化鈉-蛋白腖緩衝液中，45℃水浴15 min，作為1∶10備用液。
2.3 菌回收率測定
2.3.1 試驗組供試液1 ml與50～100 cfu驗證用菌株加入平皿中，立即傾注相應的瓊脂培養基，培養、計數。
2.3.2 菌液組測定所加驗證菌株的菌數，即50～100 cfu驗證用菌株加入平皿中，培養基注皿，培養、計數。
2.3.3 供試液對照組分別取與試驗組中等量的供試液注皿，立即傾注相應的瓊脂培養基，培養、計數。
菌回收率（%）=（試驗組平均菌落數-供試液對照組平均菌落數）/菌液組的平均菌落數×100 %
2.4 細菌、黴菌和酵母菌計數方法驗證［1］
2.4.1 常規法取“2.2”項中製備的供試液1 ml加15～20 ml菌落計數用瓊脂培養基注皿，混勻凝固後，倒置，細菌置30～35℃培養24～48 h，黴菌置23～28℃培養48～72 h；計數,測定菌回收率。
2.4.2 培養基稀釋法 取“2.2”項中製備的供試液1 ml，按0.2 ml/皿加樣,再加15～20 ml菌落計數用瓊脂培養基注皿，相應溫度培養計數，測定菌回收率。
2.5 控製菌檢查方法驗證
2.5.1 常規法分別取“2.2”項中製備的供試液各10 ml，10～100 cfu銅綠假單胞菌和10～100 cfu金黃色葡萄球菌分別加至100 ml膽鹽乳糖和100 ml營養肉湯增菌液中，按《中國藥典》2005年版微生物限度檢查方法中控製菌檢驗方法進行菌回收實驗［1］。
2.5.2 培養基稀釋法取“2.2”項中製備的供試液10 ml，10～100 cfu金黃色葡萄球菌加至200 ml營養肉湯增菌液中，按《中國藥典》2005年版微生物限度檢查方法中控製菌檢驗方法進行菌回收實驗［1］。
3 結果
驗證結果見表1～3。
表1 常規法驗證（略）
表1結果表明：人工汙染5株代表菌株，供試液對金黃色葡萄球菌、枯草杆菌有一定的抑菌性；對大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲黴無抑菌性。說明細菌計數不能采用常規法，黴菌及酵母菌計數可采用常規法。
表2 培養基稀釋法驗證（略）
表2結果表明：采用培養基稀釋法（0.2 ml/皿）可消除供試液對人工汙染金黃色葡萄球菌、枯草杆菌的抑菌作用，回收率超過70 %，因此培養基稀釋法（0.2 ml/皿）可用於細菌計數。
表3結果表明：銅綠假單胞菌驗證法采用常規法（100 ml膽鹽乳糖增菌液）；金黃色葡萄球菌驗證法采用培養基稀釋法（200 ml營養肉湯增菌液）。
4 討論
本實驗建立了消痛貼膏的微生物限度檢查方法，該法消除了藥品中抑菌物質的幹擾，能真實準確地反映出藥品中汙染存活的細菌數，檢出率高。
表3 控製菌驗證（略）
菌液製備中50～100 cfu菌數較難控製［2，3］，筆者認為驗證過程中可用此方式控製菌數，即金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白色念珠菌的菌原液稀釋至10-6、枯草杆菌、黑曲黴的菌原液稀釋至10-5，依據菌原液的濁度，吸取不同體積（0.5～1 ml之間）的稀釋液（共取2～3個點）,作為驗證實驗中的菌液組，這樣能增加回收率實驗中所加菌液數在有效值範圍內的幾率，提高實驗效率。
目的建立消痛貼膏微生物限度檢查方法。方法參照《中國藥典》2005年版微生物限度檢查方法，采用常規法和培養基稀釋法進行該藥品的微生物方法學驗證。結果采用常規法時，白色念珠菌、黑曲黴的菌回收率均高於70 %，采用培養基稀釋法（0.2 ml/皿）時，金黃色葡萄球菌、枯草杆菌、大腸埃希菌的菌回收率均高於70 %；細菌計數可用培養基稀釋法（0.2 ml/皿），黴菌和酵母菌計數可用常規法，控製菌銅綠假單胞菌可用常規法檢查，金黃色葡萄球菌可用200 ml培養基稀釋法檢查。結論該法能有效地消除藥品中抑菌物質的幹擾，檢出率高。
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