【摘要】 目的：建立陳香露白露片微生物限度檢查方法。方法：根據該樣品的微生物限度標準，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法的驗證試驗指導原則，用委托廠家3個批號的陳香露白露片進行驗證試驗，以考察確定陳香露白露片微生物限度的檢查方法。首先用常規法進行預試驗，初步考察該樣品對試驗菌檢測的影響，然後根據預試驗結果，用離心沉澱集菌法進行再試驗。結果：常規法試驗時，大腸埃希菌、白色念珠菌的回收率均大於70%，而金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率小於70%，控製菌檢查檢出試驗菌。采用離心沉澱集菌法試驗時，可以有效消除抑菌作用，使金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率大於70%。結論：采用離心沉澱集菌法可以有效消除抑菌作用，簡便、準確。
【關鍵詞】 微生物限度檢查 驗證試驗 離心沉澱集菌法
陳香露白露片是一複方中成藥製劑，由川木香、大黃、石菖蒲、陳皮、甘草、次硝酸鉍、氧化鎂、碳酸氫鈉組成，用於胃潰瘍、糜爛性胃炎、胃酸過多等疾病［1］。《中國藥典》2005年版規定，在進行藥品微生物限度檢查時，應對所用方法進行驗證，以確認所采用的方法適合於該藥品的微生物限度檢查。為此，筆者對陳香露白露片的微生物限度檢查方法進行了驗證試驗。
1 試驗材料
1.1 樣品
陳香露白露片（雲南龍發製藥有限公司；規格：100片/瓶；批號：060401、060402、060403）。
1.2 稀釋劑及培養基
pH 7.0無菌氯化鈉蛋白腖緩衝液、0.9%無菌氯化鈉溶液、TTC營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、MUG培養基、膽鹽乳糖發酵培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁培養基。
1.3 菌種
金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］，均來源於雲南省食品藥品檢驗所。
2 驗證試驗
2.1 試驗菌液的製備
接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，置30～35 ℃培養18～24 h，分別取上述培養物 1 mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液 9 mL，10倍遞增稀釋，取稀釋液1 mL，加入到1個平皿中，每種菌的每1個稀釋級平行製備2個平皿，傾注營養瓊脂培養基，置30～35 ℃培養24～48 h，計數，選擇每1 mL含菌數為50～100 cfu的稀釋級菌懸液，作為驗證試驗用菌懸液。接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，置23～28 ℃培養24～48 h，取上述培養物1 mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，10倍遞增稀釋，取稀釋液1 mL，加入到1個平皿中，每1個稀釋級平行製備2個平皿，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置23～28 ℃培養72 h，計數，選擇每毫升含菌數為50～100 cfu的稀釋級菌懸液，作為驗證試驗用菌懸液。
2.2 供試液的製備
從兩瓶樣品中取樣品10 g，至滅菌勻漿杯中，加pH 7.0無菌氯化鈉蛋白腖緩衝液至100 mL，經勻漿儀混勻，製成1∶10的供試液。陳香露白露片3個批號樣品同法操作。
2.3 細菌數、黴菌及酵母菌數計數方法的驗證
2.3.1 預試驗（常規法）
（1）試驗組：取1∶10的供試液1 mL，加入到1個平皿中，同法製備8個平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），每種菌平行製備2個平皿；取1∶100的供試液1 mL，加入到1個平皿中，同法製備8個平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），每種菌平行製備2個平皿；取1∶1 000的供試液1 mL，加入到1個平皿中，同法製備8個平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），每種菌平行製備2個平皿。含大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的試驗平皿傾注營養瓊脂培養基，置30～35 ℃培養48 h，計數；白色念珠菌的試驗平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置23～28 ℃培養72 h，計數。
（2）菌液組：分別取已製備好的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），加入到1個平皿中，每種菌平行製備2個平皿。含金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢杆菌的試驗平皿傾注營養瓊脂培養基，置30～35 ℃培養48 h，計數；白色念珠菌的試驗平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置23～28 ℃培養72 h，計數。
（3）供試品對照組：取1∶10供試液1 mL，加入到1個平皿中，同法製備4個平皿。取1∶100供試液1 mL，加入到1個平皿中，同法製備4個平皿。取1∶1 000的供試液1 mL，加入到1個平皿中，同法製備4個平皿。每一稀釋級中的2個平皿傾注營養瓊脂培養基，置30～35 ℃培養48 h，計數；每一稀釋級中的另2個平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置23～28 ℃培養72 h，計數。
（4）試驗組菌回收率計算：菌回收率（%）=（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）∕菌液組平均菌落數。
（5）結果：見表1。大腸埃希菌、白色念珠菌在樣品的1∶10、1∶100、1∶1 000供試液中回收率均大於70%；金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在樣品的1∶1 000供試液中回收率均大於70%，在樣品的1∶10、1∶100供試液中回收率均小於70%。根據上述情況，筆者采用離心沉澱集菌法進行再試驗。
2.3.2 再試驗（離心沉澱集菌法）
（1）試驗組：從100 mL的1∶10供試液中取上清液10 mL，3 000 r/min離心20 min，棄去上清液，留底部集菌液約2 mL，加pH 7.0無菌氯化鈉蛋白腖緩衝液補至10 mL，混勻。取其1 mL加入到1個平皿中，同法製備4個平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），每種菌平行製備2個平皿。另取其1 mL，加入到9 mL pH 7.0無菌氯化鈉蛋白腖緩衝液中，混勻，即為1∶100供試液。取1∶100供試液1 mL加入到1個平皿中，同法製備4個平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌懸液l mL（含50～100 cfu），每種菌平行製備2個平皿。在製備好的平皿中傾注營養瓊脂培養基，置30～35 ℃培養48 h，計數。
（2）菌液組：分別取已製備好的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），加入到1個平皿中，每種菌平行製備2個平皿，傾注營養瓊脂培養基，置30～35 ℃培養48 h，計數。
（3）供試品對照組：取1∶10供試液1 mL，加入到1個平皿中，同法製備2個平皿。取1∶100供試液1 mL，加入到1個平皿中，同法製備2個平皿。同法製備4個平皿。傾注營養瓊脂培養基，置30～35 ℃培養48 h，計數。
（4）試驗組菌回收率計算：菌回收率（%）=（試驗組平均菌落數﹣供試品對照組平均菌落數）∕菌液組平均菌落數
（5）結果：見表2。采用離心沉澱集菌法後，可去除供試液對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌作用，使菌回收率大於70%。
2.4 控製菌檢查方法的驗證
2.4.1 大腸埃希菌檢查方法的驗證
（1）試驗組：取1∶10供試液10 mL和大腸埃希菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），加入到膽鹽乳糖增菌液100 mL中，置35～37 ℃培養18～24 h，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸埃希菌檢查法進行檢查。
（2）陰性對照組：取1∶10供試液10 mL和金黃色葡萄球菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），加入到膽鹽乳糖增菌液100 mL中，置35～37 ℃培養18～24 h，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸埃希菌檢查法進行檢查。
（3）供試品對照組：取1∶10供試液10 mL，加入到膽鹽乳糖增菌液100 mL中，置35～37 ℃培養18～24 h，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸埃希菌檢查法進行檢查。
（4）結果：試驗組檢出大腸埃希菌，陰性菌對照組結果為陰性，供試品對照組未檢出大腸埃希菌。
2.4.2 大腸菌群檢查方法的驗證
（1）試驗組：取1∶10、1∶100、1∶1 000供試液各1 mL和大腸埃希菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），加入到3支膽鹽乳糖發酵培養液中，置35～37 ℃培養18～24 h，按《中國藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸菌群檢查法進行檢查。
（2）陰性對照組：取1∶10、1∶100、1∶1 000供試液各1 mL和金黃色葡萄球菌的菌懸液1 mL（含50～100 cfu），加入到3支膽鹽乳糖發酵培養液中，置35～37 ℃培養18～24 h，按《中國藥典》2005版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸菌群檢查法進行檢查。
（3）供試品對照組：取1∶10、1∶100、1∶1 000供試液各1 mL，加入到3支膽鹽乳糖發酵培養液中，置35～37 ℃培養18～24 h，按《中國藥典》2005版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸菌群檢查法進行檢查。
（4）結果：試驗組檢出大腸菌群，陰性菌對照組結果為陰性，供試品對照組未檢出大腸菌群。
3 討論
采用常規法試驗時，該樣品對大腸埃希菌、白色念珠菌的加菌回收率均大於70%，證明其對上述2種供試菌無抑菌作用。該樣品對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑菌作用，在1∶10、1∶100的稀釋級，其加菌回收率小於70%，低於《中國藥典》2005年版規定的回收率不得低於70%才視為無抑菌作用的要求。結合該樣品的物理特性和常規法試驗結果，采用離心沉澱集菌法進行試驗後，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的加菌回收率可大於70%。故陳香露白露片的細菌數檢查可采用離心沉澱集菌法，黴菌及酵母菌數的檢查采用常規法。
由控製菌檢查方法的驗證試驗結果表明，采用常規法試驗時，該樣品對大腸埃希菌、大腸菌群的檢查無幹擾，故陳香露白露片的控製菌檢查可采用常規法。
因安全原因，黑曲黴［CMCC（F）98003］的驗證試驗未進行。
【參考文獻】
［1］ 衛生部藥典委員會. 衛生部藥品標準. 中藥成方製劑(第八冊)［S］. 北京： 人民衛生出版社， 1993: 87.
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