【關鍵詞】 滋陰明目丸；微生物限度檢查；驗證試驗
滋陰明目丸是由熟地黃、黃精、枸杞子、山藥、當歸、川芎等17味中藥組方而成的複方製劑。對其進行微生物限度檢查時,按照規定[1],必須進行方法驗證試驗,為此本試驗對滋陰明目丸微生物限度的具體檢查方法進行了驗證,現總結現報道如下。
1 儀器與試藥
Q/YYX1030-82型電熱手提式壓力滅菌器；101-2s電熱恒溫鼓風幹燥箱(上海躍進醫療器械廠)；DHP781型恒溫培養箱(湖北省黃石市醫療器械廠)；SPX-250C型恒溫恒濕培養箱(上betway必威西汉姆联迅實業有限公司醫療設備廠)；SPX-103型淨化工作台(安徽蚌淨化設備廠)；漩渦混合器(江蘇海門麒麟醫用儀器廠)；CSY-Ⅱ型不鏽鋼電熱恒溫水浴鍋(北京醫療設備廠)。
菌種：大腸埃希菌[CMCC(B)44102]；金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；枯草芽孢杆菌 [CMCC(B)63501]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲黴菌[CMCC(F)98003]。
營養瓊脂培養基(中國藥品生物製品檢定所,批號20050103)；玫瑰紅鈉瓊脂培養基(中國藥品生物製品檢定所,批號20061109)；膽鹽乳糖增菌培養基(中國藥品生物製品檢定所,批號20070106)；改良馬丁瓊脂培養基(中國藥品生物製品檢定所,批號20060915)；MUG快檢試劑(中國藥品生物製品檢定所,批號20061211)；蛋白腖(上海中洋生物公司東海藥廠,批號060512)。其他試劑均為分析純。pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝溶液,照2005年版《中華人民共和國藥典》(一部)配製。
試驗樣品：滋陰明目丸(本院自製,批號070305、070419、070821)。
2 實驗方法與結果
2.1 菌液製備
取經37 ℃培養18～24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢杆菌3種菌種,分別接種於10 mL營養肉湯中,置37 ℃培養箱中接著18～24 h,用0.9%滅菌氯化鈉溶液稀釋至1O-5～1O-7約為5O～100 cfu,備用。
取白色念珠菌接種於10 mL改良馬丁培養基中,置23～28 ℃培養18～24 h,用0.9%滅菌氯化鈉溶液稀釋至1O-5～1O-7約為5O～100 cfu,備用。
取經23～28 ℃培養1周的黑曲黴改良馬丁瓊脂斜麵培養物,加0.9%無菌氯化鈉溶液3～5 mL,將孢子洗脫,用管口帶有薄無菌棉花的無菌毛細吸管吸出孢子懸液,置無菌試管內,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋為1 mL含孢子數5O～100 cfu的孢子懸液,備用。
2.2 供試液的製備
各取2個最小包裝共10 g供試品(批號060402),加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液至100 mL,振搖,使分散均勻,作為1∶10的供試液。
2.3 細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證
試驗組：取供試液1 mL和5O～100 cfu試驗菌,分別注入平皿中,每株菌平行製備2個平皿。菌液組：測定所加的試驗菌數。供試品對照組：取供試液注入平皿中,測定供試品本底菌數。稀釋劑對照組：取稀釋劑和5O～100 cfu試驗菌,分別注入平皿中,測定每株平行製備2個平皿。結果見表1。表1 回收率測定結果（略）
表1結果表明,3次平行試驗,滋陰明目丸5株菌的回收率均大於7O%,表明滋陰明目丸按常規法進行細菌、黴菌及酵母菌計數,經方法學驗證試驗成立。
2.4 大腸菌群的驗證試驗
試驗組：取1∶10、1∶100的供試液1 mL,分別接入10 mL膽鹽乳糖發酵培養基中,分別加入大腸埃希菌混懸液1 mL, 30～35 ℃培養24 h,觀察結果。陰性對照組：除菌液為金黃色葡萄球菌1 mL,方法同試驗組。陽性對照組：除不加供試液,其他操作同試驗組。結果見表2。表2 大腸菌群驗證試驗結果（略）
2.5 控製菌驗證試驗
試驗組：取批號為060402的1∶10供試液10 mL,加入大腸埃希菌液1 mL,接入100 mL膽鹽乳糖培養基中,35 ℃培養24 h；取上述培養物0.2 mL,接種至5 mL MUG培養基的試管中,35 ℃培養24 h；觀察後,沿管壁加入數滴靛基質試液,觀察結果。陰性菌對照組：除菌液為金黃色葡萄球菌1 mL,方法同試驗組。陽性對照組：除不加供試液,其他操作同試驗組。結果見表3。表3 大腸埃希菌驗證試驗結果（略）
滋陰明目丸3次平行試驗,試驗組都檢出大腸埃希菌,陰性菌對照組都未檢出金黃色葡萄球菌,表明滋陰明目丸的控製菌檢查方法按常規法,經方法學驗證試驗成立。
2.6 樣品檢驗結果
取滋陰明目丸3批供試品(070305、070419、070821)稀釋液按常規法進行細菌、黴菌及酵母菌計數、控製菌檢查,經檢驗符合規定。
3 結論
通過方法學驗證試驗得出：滋陰明目丸可按常規法進行微生物限度檢查；進行黴菌及酵母菌計數和控製菌檢查,按培養基稀釋法(0.2 mL/皿)進行細菌計數。
4 討論
由於中成藥是含有多種成分的複合製劑,作用機理並不十分明確,其中任何成分具有抑菌作用均可影響微生物限度檢查的準確性。因此,在研究滋陰明目丸微生物檢查方法時,以2005年版《中華人民共和國藥典》作為依據,並參考文獻[2-3]將5種陽性對照菌的回收率作為評價所采用的方法是否適合於本品種。
采用常規法檢查滋陰明目丸的細菌、黴菌及酵母菌,回收率顯示,本品對大腸埃希菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲黴均無抑製性。采用常規法檢查滋陰明目丸的控製菌,結果符合藥典規定。
【參考文獻】
[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：化學工業出版社,2005.附錄70.
[2] 中國藥品生物製品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規範[M].北京：中國醫藥科技出版社,2005.326－328.
[3] 馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊[M].北京：科學出版社,2000.65.
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