龍膽瀉肝丸微生物限度檢查方法驗證

【摘要】  目的：建立一種龍膽瀉肝丸微生物限度檢查方法。方法：采用藥典規定的常規法和稀釋法，通過驗證確認所采用的方法是否適合於*該藥品的細菌、黴菌和酵母菌、控製菌的檢查。結果：細菌、黴菌和酵母菌方法驗證中回收率在70%以上;控製菌方法驗證中陽性對照菌檢出，陰性對照菌未檢出。結論：龍膽瀉肝丸微生物限度檢查法的細菌、黴菌和酵母菌數可以采用常規法或稀釋法進行檢查，控製菌檢查可以采用常規法檢查。

【關鍵詞】  微生物限度; 驗證

當建立藥品的微生物限度檢查時，應進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所采用的方法適合於該藥品的細菌、黴菌及酵母菌的測定。驗證試驗可與供試品的細菌、黴菌及酵母菌計數同時進行。

　　1 實驗材料

　　1.1 培養基

　　營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、膽鹽乳糖發酵培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁液體培養基、改良馬丁瓊脂培養基、MUG培養基、靛基質試液。

　　1.2 菌種

　　大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲黴[CMCC(F)98003]。

　　1.3 供試品

　　龍膽瀉肝丸。

　　2 菌液的製備

　　2.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液製備

　　取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的營養瓊脂斜麵培養物接種於10ml營養肉湯培養基中，35～37℃培養18～24小時;取培養液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6或10-7，製成每1ml含菌數50～100cfu的菌懸液。

　　2.2 白色念珠菌菌液製備

　　取白色念珠菌的改良馬丁瓊脂斜麵培養物接種於10ml改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48小時;取培養液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6或10-7，製成每1ml含菌數50～100cfu的菌懸液。

　　2.3 黑曲黴菌液製備

　　取黑曲黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜麵培養基中，23～28℃培養5～7天，加入3～5ml0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無菌試管中，取1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4～10-6，製成每1ml含孢子數50～100cfu的孢子懸液。

　　3 供試液的製備

　　取供試品10g，加pH7.0的無菌氯化鈉蛋白腖緩衝液至100ml,用勻漿儀混勻，作為1:10供試液。

 　 4 回收率測定

    4.1.1 試驗組

　　(1)常規法：取1:10供試液1ml、菌液(10-6約50～100cfu)1ml，分別同時注入於平皿中，做10個平皿;立即傾注營養瓊脂培養基，待凝固後，置30～35℃培養48小時，逐日觀察結果。(2)稀釋法：取1:10供試液1ml等量分注入於5個平皿中，每個平皿加試驗菌 (10-6約50～100cfu)1ml，立即傾注營養瓊脂培養基，待凝固後，置30～35℃培養48小時，逐日觀察結果。

　　4.1.2 菌液組 取上述試驗菌液，測定每一菌株所加的試驗菌菌數。采取平皿法，取試驗用的菌液(10-6約50～100cfu)1ml，分別注入平皿中，立刻傾注培養基，每株試驗菌平行製備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。

　　4.1.3 供試品對照組 (1)常規法：取1:10供試液1ml注入於平皿中，做2個平皿;立即傾注營養瓊脂培養基，待凝固後，置30～35℃溫度培養48小時，逐日觀察結果。(2)稀釋法：取1:10供試液1ml等量分注於5個平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，待凝固後，置30～35℃培養48小時，逐日觀察結果。

　　4.2 黴菌、酵母菌回收率測定

　　4.2.1 試驗組 取1:10供試液1ml、菌液(10-6約50～100cfu)1ml，分別同時注入於平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固後，置23～28℃培養72小時，逐日觀察結果。

　　4.2.2 菌液組 同4.1.2。

　　4.2.3 供試品對照組 取1:10供試液1ml注入於平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉培養基，待凝固後，置規定溫度培養72小時，逐日觀察結果。

　　4.3 細菌、黴菌和酵母菌計數及驗證結果

　　表1 細菌、黴菌和酵母菌計數及方法驗證的試驗　以上數據為3次試驗結果(注：稀釋法中枯草芽孢杆菌回收率不易達到70%)。

　　5 控製菌方法的驗證

　　取2瓶100ml膽鹽乳糖培養基，分別加入1:10供試液各10ml，其中1瓶加入大腸埃希菌液1ml,另1瓶加入金黃色葡萄菌液1ml，置35～37℃培養24小時，分別取上述培養液0.2ml接種於5mlMUG培養基中，培養於5小時、24小時在366nm紫外線下觀察，觀察後，沿培養管的管壁加入數滴靛基質試液。試驗重複3次(表2)。表2 控製菌檢查方法驗證試驗結果

　　6 討論

　　由表1結果看出，細菌、黴菌和酵母菌試驗組的回收率在70%以上，說明龍膽瀉肝丸微生物限度檢查法的細菌數和黴菌、酵母菌數可以采用常規法和稀釋法兩種方法中的任一種進行測定。由表2結果可以看出，陽性對照菌檢出，陰性對照菌未檢出，說明龍膽瀉肝丸控製菌檢查可以采用常規法測定。

【參考文獻】
  　1國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典.北京：化工工業出版社，2005.

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