培養材料采集
要根據培養目的適當選取材料,選擇原則:易於誘導、帶菌少。要選取植物組織內部無菌的材料。這一方麵要從健壯的植株上取材料,不要取有傷口的或有病蟲的材料。另一方麵要在晴天,最好是中午或下午取材料,決不要在雨天、陰天或露水未幹時取材料。因為健壯的植株和晴天光合呼吸旺盛的組織,有自身消毒作用,這種組織一般是無菌的。
培養材料的消毒
從外界或室內選取的植物材料,都不同程度地帶有各種微生物。這些汙染源一旦帶人培養基,便會造成培養基汙染。因此,植物材料必須經嚴格的表麵滅菌處理,再經無菌操作手續接到培養基上。
試劑
· 乙醇。
· 吲哚乙酸( IAA) 或 2 ,4 – D (生長素類似物)。
· 氯化汞(升汞)或次氯酸鈉。
· 6- 苄基氨基腺嘌呤( 6-BA )
· MS 培養基
·0.1 mol/L NaOH與 0.1 mol/L HCl
配製培養基
( 1 )愈傷組織誘導培養基: MS 培養基(蔗糖含量為 10 g/L , 2,4 – D 含量為 2 mg/L ,瓊脂 10 g/L )。
( 2 )試驗培養基:在 MS 培養基中加入 IAA 和 6–BA 。
吲哚乙酸(IAA)先用少量 0.1 mol/L NaOH 溶解, 6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量 0.1 mol/L HCl 溶解,然後用蒸餾水稀釋,再加入培養基中。
儀器設備 培養室,高壓滅菌鍋,水浴鍋,解剖刀,三角燒瓶( 100mL ),燒杯,量筒,培養皿,棉線,接種箱或超淨工作台,分析天平,長鑷子,剪刀,容量瓶,移液管,牛皮紙。
培養基滅菌 將配好的培養基加入瓊脂加熱溶解,調至 pH 5.8 ,趁熱分裝於 100 mL 三角燒瓶中,每瓶約 20 mL 。待培養基冷卻凝固後,用一層稱量紙和一層牛皮紙包紮瓶(管)口,並用棉線紮牢,然後在高壓滅菌鍋中 121 ℃( 1 kg/cm 2 )下滅菌 20 min 。取出三角燒瓶放在台子上,冷卻後備用。接種操作所需的一切用具(如長鑷子、解剖刀、剪刀等)及滅菌水,需同時滅菌。
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