甘草有益微生物的研究進展

【摘要】  植物體內大量分布的微生物對植物產生的影響已成為人們關注的熱點，特別是那些有益的影響可對植物的生長及活性成分的形成產生一定的作用。甘草作為一種大宗中藥，其栽培品的質量一直是人們所關心的問題，甘草有益微生物對提高甘草的品質有重要作用。該文綜述了甘草有益微生物的研究進展，以期對提高栽培甘草的質量起到指導意義。

【關鍵詞】  甘草; 內生菌; 根瘤菌; 菌根真菌

甘草是豆科甘草屬(Glycyrrhiza)植物，其根及根莖為常用中藥，市場需求量大。近年來，隨著野生甘草資源的急劇減少，且國家明令禁止采挖野生甘草，使甘草供求矛盾日益尖銳。在這種情況下，對甘草資源的保護性利用及栽培甘草勢在必行。近年來，隨著人工甘草種植麵積的逐年加大，提高甘草的質量成為亟待解決的一個關鍵問題。相關研究表明，植物有益微生物可以產生促植物生長的活性物質，提高植物固氮性能，促進植物對惡劣環境的適應，加強係統的生態平衡，保證寄主植物健康生長。因此本文就近年來甘草有益微生物的研究進展進行綜述，以期對提高栽培甘草的質量有指導意義。

　　1  甘草內生菌的研究現狀

    內生菌是指一生或至少一生中的某個階段能進入活體植物組織內，並且不引起明顯組織變化的真菌或細菌［1,2］。1993年，Strobel等［3］從短葉紅豆杉Taxus brevifolia Nutt的樹皮中分離出二百多種微生物，其中有一株內生真菌Taxomyces andreanae能產生紫杉醇，這一研究結果引起學者對內生菌的廣泛興趣。目前，人們已經從長春花、千層塔、銀杏、厚樸等多種植物中分離得到了內生菌，並取得了一些成果。

    有學者對甘草內生菌也進行了研究，發現內生菌對甘草產生一係列作用。宋素琴等［4］對采自新疆的健康野生脹果甘草不同組織中的內生菌進行分離，並純化得到149株細菌和2株真菌，鑒定得出149株細菌分屬於13個屬，2株真菌分屬於青黴菌屬Penicillium和鐮刀菌屬Fusarium。有學者發現內生菌可通過拮抗病原菌促進甘草生長。饒小莉等［5］從烏拉爾甘草健康植株的根莖葉中共分離到內生細菌98株，並采用平板對峙方法篩選出6株菌株，其對植物病原菌有明顯體外拮抗活性，鑒定這6株拮抗菌株分屬萎縮芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、多粘類芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Paenibacillus ehimensis。龔明福等［6］采用無菌操作技術從野生健康甘草Glycyrrhiza uralensis的根、莖、葉、種子、根瘤等組織中分離出內生細菌（Endophytic bacteria)125株，其中31株對棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)具有較強的拮抗活性，這31株內生細菌分屬於氣芽孢杆菌屬(Aerobacillus sp.)、氣單胞菌屬(Aeromonas sp.)、芽孢杆菌屬(Bacillus sp.)、黃單孢杆菌屬(Xanthomonas sp.)、假單胞杆菌屬(Pseudomonas sp.)、土壤杆菌屬(Agrobacterium sp.)。另有研究發現，從甘草中分離的有些內生菌還可產生活性物質。韋革宏等［7］從烏拉爾甘草和光果甘草中共分離得到68株內生菌，從中篩選出一個來自烏拉爾甘草的菌株Mesorhizobium sp. CCNWGX022，從該菌株發酵液的石油醚提取物中分離得到了十八烷酸內酯Rhizobialide，是第一次從內生菌中得到此類物質。另有學者研究了內生菌在甘草不同部位及不同月份的數量變化趨勢。林世利等［8］分離出不同月份苦豆子、駱駝刺、苜蓿、鈴鐺刺、甘草不同部位的內生細菌，研究阿拉爾地區豆科植物內生細菌種群動態。結果顯示5月份的苦豆子和甘草植株、8月份的苜蓿植株、9月份的鈴鐺刺和駱駝刺植株的內生細菌的種類最多。內生細菌種類的分布規律依次為苦豆子中葉＞莖＞根＞種子＞花，苜蓿中根＞葉＞莖＞花＞種子，鈴鐺刺中莖＞葉＞種子＞花＞根，駱駝刺中根＞莖≥葉＞種子＞花，甘草中莖＞根＞葉＞種子＞花。5種豆科植物生長期中總帶菌量平均值在各個月份變化趨勢不同，並且各個月份的帶菌量處於交替變化之中，說明不同月份5種豆科植物內生細菌的種類和數量不同，同種豆科植物不同組織部位的內生細菌的種類和數量有差異。

　　2  甘草根瘤菌的研究現狀

    根瘤菌是與豆科植物共生，形成根瘤並固定空氣中的氮氣供植物營養的一類杆狀細菌。這種共生體係具有很強的固氮能力。根瘤菌分快生和慢生兩種類型，為化能異養菌。目前有學者已經從甘草中分離得到根瘤菌並進行了一些相關研究。

    目前對甘草根瘤菌的研究多體現在根瘤菌的分類上。楊雪穎等［9］通過對西北幹旱半幹旱地區68株甘草根瘤菌的表型多樣性和抗逆性分離研究，發現1個新類群和1個具有較高抗逆性的菌株。對新類群的中心菌株CCNWGX022和高抗性菌株CCNWGX035進行16SrDNA全序列測定及係統進化研究。結果表明，CCNWGX022和CCNWGX035與中慢生根瘤菌屬內參比菌株的16SrDNA相似性分別大於96.8％和98.3％，判定它們均屬於中慢生根瘤菌屬。穀峻等［10］采用表型數值分類、16S rDNA PCR-RFLP分析和BOX-PCR指紋圖譜分析的方法對中國北方地區的甘草根瘤菌進行表型、遺傳多樣性分析。供試菌株在數值分類聚類分析中約85％的相似水平上產生2個表觀群，有11株菌未與已知參比菌株聚群。16Sr DNA PCR-RFLP分析表明，供試的20株菌共產生14種遺傳型，表現出豐富的遺傳多樣性。BOX-PCR指紋圖譜分析進一步證明與甘草共生的根瘤菌的基因組也具有多樣性。由此得出結論：在中國北方地區與甘草共生的根瘤菌在Sinorhizobium、Rhizobium和Mesorhizobium屬中均有分布。

　　3  甘草菌根真菌的研究現狀

    菌根是土壤中某些真菌與植物根的共生體。凡能引起植物形成菌根的真菌稱為菌根真菌，大部分屬擔子菌亞門，小部分屬子囊菌亞門。菌根真菌與植物之間建立相互有利、互為條件的生理整體，並各有形態特征，這是真核生物之間實現共生關係的典型代表。根據形態和解剖學的特征，又把菌根分為外生菌根和內生菌根兩大類。有學者對甘草菌根真菌進行研究發現菌根真菌可促進甘草的生長。饒小莉等［11］分離了甘草的VA菌根，並用三葉草進行單孢繁殖，將繁殖後的菌根真菌回接甘草，結果發現接種了菌根真菌的甘草植株筆長、根粗、莖葉幹重和根幹重都有較大程度的提高，均比對照顯著增加，並且不同處理對植株生長影響不同，得出結論接種VA菌根真菌顯著促進了甘草的營養生長。Jingnan Liu等［12］用兩種AM菌根真菌Glomus mosseae與Glomus versiforme接種甘草，結果顯示接種的甘草相對於對照組在生長的早期和晚期有顯著提高，葉攝取磷的量比對照組多，並且根中甘草酸的濃度有所升高，但根部氧化酶活性相對降低了，由此得出結論接種AM菌根真菌有可能成為提高甘草藥用價值的有效途徑。

    4  甘草其他微生物學相關研究現狀

    近年來，對甘草微生物學轉化等方麵的研究工作也取得了一定成果。謝毛成［13］利用發根農杆菌的Ri質粒，以光果甘草種子胚萌發形成的實生苗不同部位為外植體，成功誘導出光果甘草毛狀根，並利用TLDNA中rolC序列中的特異性引物，應用PCR技術對光果甘草毛狀根進行了分子水平的鑒定，並利用理化手段對毛狀根轉化後產生的冠瘦堿進行了薄層定性鑒定，從不同水平上證實了光果甘草毛狀根核基因組中已整合了外源Ri質粒的T-DNA片段。燕飛等［14］利用發根農杆菌R1601對藥用植物脹果甘草(Glycyrrhiza inflat Bat)進行轉化，誘導其產生發根。在發根誘導過程中，分別用不同菌液濃度、不同浸染時間對脹果甘草子葉、胚軸進行轉化處理，統計、比較各條件下的發根率，結果表明，用稀釋2倍的菌液浸染子葉8 min時，發根誘導率最高,為56.49%。何晨等［15］用一株產β-葡糖醛酸酶的菌種HC-12對甘草進行液體發酵轉化。通過對菌種複合誘變以及應用係統數值化及靈敏值係統調控技術優化了發酵工藝，把甘草中不足0.1%的甘草次酸的含量提高了20倍以上。經過柱層析及HPLC及1H NMR鑒定分離得到了甘草次酸純品，並通過動物實驗驗證了發酵甘草於未發酵的生品對照甘草具有抗炎活性和鎮痛作用顯著性效果。

　　5  小結

    內生菌對甘草的有益作用體現在：①內生菌有促進甘草生長作用，內生菌可與病原菌競爭營養或直接產生拮抗物質而抑製病原菌，從而促進甘草生長。②有些內生菌可產生活性物質。③內生菌在甘草不同部位及不同月份的數量呈現一定的變化趨勢。另有研究表明，內生菌能產生與宿主相同的活性物質［3］，王興紅［16］推測內生真菌可能與中藥的道地性有密切的關係。這些成果對於甘草內生菌的研究有重要意義。

    根瘤菌對甘草的有益作用體現在：根瘤菌能夠通過與甘草共生，引起甘草根部或莖部結瘤，將空氣中的N2轉化為可吸收利用的NH4，從而為甘草提供氮素營養，促進其生長。

    菌根真菌對甘草的有益作用體現在：甘草和菌根真菌是一種互惠共生的關係，它們之間可以交換各自所需的物質，甘草借助菌根真菌吸收水分、養分和生長促進劑，而菌根真菌也從甘草中攝取自身生長所需要的糖分和其它有機物。菌根真菌是根係的延長和擴展，且比根係吸收水分、養分的能力大得多，可促進甘草的營養生長，提高甘草的藥用價值。

    微生物轉化對甘草的作用體現在：對甘草進行微生物轉化，可提高其有效成分含量，用藥效果可得到提高。

    總之，微生物是個潛力巨大、尚待開發的資源，對甘草相關微生物進行研究有重大意義，有利於提高甘草的質量，對於中藥的可持續發展也將起到重大作用。

【參考文獻】
  　［1］Pertini O. Fungal endophytes of tree leaves ［A］. In: Andrews J H. Hirano SS. eds. Microbial Ecology of Leaves［C］. INew York,Springer-Verlag, 1991：179.

　　［2］Wilson D. Endophyte-the evolution of a term, and clarification of its use and definition ［J］. Oikos,73:274.

　　［3］Stierle A, Strobel G, Stierle D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of pacific yew［J］. Science, 1993, 260 (5105): 214.

　　［4］宋素琴，歐提庫爾瑪合木提,張誌東，等.新疆脹果甘草內生菌的分離和鑒定［J］. 微生物學通報, 2007, 34(5): 867.

　　［5］饒小莉, 沈德龍，李 俊，等.甘草內生細菌的分離及拮抗菌株鑒定［J］. 微生物學通報, 2007, 34(4): 700.

　　［6］龔明福，林世利，張前峰，等. 拮抗棉花枯、黃萎病菌的甘草內生細菌初步研究［J］. 塔裏木大學學報, 2007, 19(2)：49.

　　［7］Ge-Hong Wei, Xue-Ying Yang, Ji-Wen Zhang, et al. Rhizobialide, a new stearolactone produced by rhizobial Mesorhizobium sp. CCNWGX022, an endophyte from Glycyrrhiza uralensis［J］. Chemistry & Biodiversity, 2007, 4(5):893.

　　［8］林世利, 李真，馬玉紅，等. 阿拉爾地區幾種豆科植物內生細菌種群動態研究［J］. 安徽農業科學, 2007, 35(33)：10822.

　　［9］楊雪穎, 張執欣, 楊亞珍,等.甘草根瘤菌的16S rDNA全序列測定及係統進化分析［J］. 西北植物學報, 2006, 26(4):707.

　　［10］穀峻,陳文新.中國北方地區甘草根瘤菌表型及遺傳多樣性研究［J］. 中國農業科學, 2006, 39(7): 1321.

　　［11］饒小莉.甘草有益微生物的分離鑒定及共接種效果初探［D］. 北京: 中國農業科學院研究生院資源區劃研究所, 2007.

　　［12］Jingnan Liu. Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on the growth, nutrient uptake and glycyrrhizin production of licorice (Glycyrrhiza uralensis Fisch)［J］. Plant Growth Regul, 2007, 52:29.

　　［13］謝毛成. Ri質粒轉化光果甘草的研究［M］.南京:中國藥科大學, 2003.

　　［14］燕飛,梁玉玲，崔東亞,等.發根農杆菌轉化脹果甘草的研究［J］. 河北大學學報, 2004, 24(5): 526.

　　［15］何晨，霍蕾，王建芳，等.甘草的微生物轉化［J］. 天然產物分離, 2005, 3(6):1.

　　［16］王興紅.內生真菌與天然產物研究進展［J］. 中草藥,2007,38(1):140.

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